Visualización y cuantificación de las interacciones endógenas de proteínas intraorgánulas en los sitios de contacto ER-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad
Summary
La necesidad de nuevos enfoques para estudiar los sitios de contacto de membrana (MCS) ha crecido debido al creciente interés en el estudio de estas estructuras celulares y sus componentes. Aquí, presentamos un protocolo que integra tecnologías de microscopía previamente disponibles para identificar y cuantificar complejos de proteínas intra-orgánulos e inter-orgánulos que residen en los SQM.
Abstract
Los sitios de contacto de membrana (MCS) son áreas de proximidad cercana a la membrana que permiten y regulan el intercambio dinámico de diversas biomoléculas (es decir, calcio y lípidos) entre los orgánulos yuxtapuestos sin involucrar la fusión de la membrana. Las SQM son esenciales para la homeostasis celular, y sus funciones están aseguradas por los componentes residentes, que a menudo existen como complejos de proteínas multiméricas. Las SQM a menudo involucran el retículo endoplásmico (RE), un sitio importante de síntesis de lípidos y almacenamiento de calcio celular, y son particularmente importantes para los orgánulos, como las mitocondrias, que están excluidos de las vías clásicas de transporte vesicular. En los últimos años, las SQM entre el RE y las mitocondrias han sido ampliamente estudiadas, ya que sus funciones tienen un fuerte impacto en el metabolismo/bioenergética celular. Se han comenzado a identificar varias proteínas en estos sitios de contacto, incluidas las ataduras de membrana, los canales de calcio y las proteínas de transferencia de lípidos, lo que plantea la necesidad de nuevas metodologías y enfoques técnicos para estudiar estos componentes de la SQM. Aquí, describimos un protocolo que consiste en enfoques técnicos combinados, que incluyen el ensayo de ligadura de proximidad (PLA), la tinción de mitocondrias y la segmentación por imágenes 3D, que permite la detección de proteínas que están físicamente cerca (>40 nm) entre sí y que residen en la misma membrana en los MCS ER-mitocondrias. Por ejemplo, utilizamos dos proteínas de transferencia de lípidos ancladas al RE, ORP5 y ORP8, que previamente se ha demostrado que interactúan y se localizan en las MCS de la mitocondria del RE y de la membrana plasmática del RE. Al asociar el PLA ORP5-ORP8 con el análisis de software de imágenes celulares, fue posible estimar la distancia del complejo ORP5-ORP8 desde la superficie mitocondrial y determinar que aproximadamente el 50% de la interacción ORP5-ORP8 PLA ocurre en los subdominios RE en las proximidades de las mitocondrias.
Introduction
La comunicación entre orgánulos es una característica definitoria de las células eucariotas. Una forma en que los orgánulos se comunican es mediante la formación de sitios de contacto de membrana (MCS), que son oposiciones de membrana cercanas entre dos orgánulos que son mantenidas por proteínas estructurales y funcionales, como ataduras, proteínas de transferencia de lípidos y canales de calcio1. Los SQM pueden establecerse entre orgánulos similares o diferentes, y median el intercambio de componentes celulares, lo cual es importante para mantener la homeostasis celular. Hasta la fecha, se han identificado varias SQM, incluidos los contactos del retículo endoplásmico (RE)-mitocondrias, RE-membrana plasmática (PM) y ER-gotitas lipídicas (LD)1. Entre ellas, las que se forman entre el RE y las mitocondrias (MERCSs) se encuentran entre las más estudiadas, ya que están implicadas en la regulación de varias funciones celulares, entre ellas la homeostasis lipídica y cálcica2. Dado que las mitocondrias están excluidas en gran medida de las vías clásicas de transporte vesicular, dependen de MERCS y de sus constituyentes moleculares para importar lípidos o precursores lipídicos clave del RE. El transporte no vesicular de estos lípidos a través de los MERCS garantiza el mantenimiento de la composición lipídica mitocondrial adecuada, así como su integridad funcional y estructural3.
Dada la participación crucial de las SQM en diversas funciones celulares, el interés por proporcionar una comprensión más profunda de sus componentes moleculares ha aumentado considerablemente en los últimos años. Se han utilizado varios tipos de enfoques basados en imágenes para avanzar en el conocimiento de las SQM. Entre ellos, el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) basado en sonda de fluorescencia ha sido ampliamente utilizado como indicador de la abundancia de SQM mediante la detección de interacciones proteína-proteína entre orgánulos (en un rango de detección de 40 nm) a niveles endógenos4. Por ejemplo, los MERCS se han visualizado y cuantificado mediante el uso de PLA entre varios pares de proteínas mitocondrias-ER, incluidos VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 y PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Aunque esta tecnología se ha utilizado para detectar y cuantificar las interacciones proteína-proteína entre orgánulos que están presentes en el MCS 5,7,9,10,11, la mayoría de los estudios no combinaron PLA con tinción de orgánulos. En consecuencia, aún no se ha desarrollado un método cuantitativo que permita medir la proximidad entre las interacciones del PLA y los orgánulos asociados. Por lo tanto, hasta ahora, en el caso de las proteínas RE, su interacción dentro de los subdominios de membrana en contacto con otros orgánulos no se ha distinguido de su interacción dentro de la red RE ampliamente distribuida.
Aquí, describimos un protocolo para detectar interacciones de PLA entre proteínas que residen en la membrana del mismo orgánulo y analizar su proximidad a la membrana del orgánulo asociado en el MCS. Este protocolo se desarrolló en base a dos premisas: 1) estudios previos que muestran que, en condiciones de sobreexpresión, las proteínas de transferencia de lípidos del RE ORP5 y ORP8 se colocalizan e interactúan en las mitocondrias del RE y en los MCS del RE-PM 12,13,14,15 y que el ORP5 se localiza en los contactos del RE-LD 16,17; 2) las tecnologías existentes, como el PLA, la microscopía confocal, el marcaje de orgánulos y el análisis de imágenes en 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fue diseñado para identificar y cuantificar las interacciones de PLA entre las proteínas de los orgánulos en los SQM, en particular en los MERCS. La novedad del protocolo es que combina el PLA con el marcaje de múltiples orgánulos, la microscopía confocal y el análisis de imágenes 3D para localizar y cuantificar las interacciones del PLA entre dos proteínas que residen en la misma membrana, en este caso dentro de la membrana del RE en estrecha proximidad con la membrana de las mitocondrias (MAM) o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), el Programa ATIP-Avenir, la Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) y la Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), la I’Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Ciencias de las Plantas Saclay).
Materials
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
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