通过邻近连接测定可视化和定量ER-线粒体接触部位的内源性细胞器内蛋白相互作用
Summary
由于对这些细胞结构及其组分的研究兴趣日益浓厚，对研究膜接触位点（MCS）的新方法的需求也在增长。在这里，我们提出了一种协议，该协议集成了以前可用的显微镜技术，以识别和量化驻留在MCS中的细胞器内和细胞器间蛋白质复合物。
Abstract
膜接触位点（MCS）是膜紧密接近的区域，允许并调节并列细胞器之间不同生物分子（即钙和脂质）的动态交换，而不涉及膜融合。MCS对于细胞稳态至关重要，其功能由常驻成分确保，常驻成分通常以多聚体蛋白质复合物的形式存在。MCS通常涉及内质网（ER），这是脂质合成和细胞钙储存的主要部位，对于细胞器（例如线粒体）尤其重要，这些细胞器被排除在经典囊泡运输途径之外。在过去的几年中，ER和线粒体之间的MCS已经被广泛研究，因为它们的功能强烈影响细胞代谢/生物能量学。在这些接触位点已经开始鉴定几种蛋白质，包括膜系、钙通道和脂质转移蛋白，因此提出了研究这些 MCS 组分的新方法和技术方法的需求。在这里，我们描述了一种由组合技术方法组成的协议，包括邻近连接测定（PLA），线粒体染色和3D成像分割，允许检测物理上彼此接近（>40nm）并且位于ER-线粒体MCS的同一膜上的蛋白质。例如，我们使用了两种ER锚定的脂质转移蛋白ORP5和ORP8，它们先前已被证明在ER-线粒体和ER-质膜MCS中相互作用和定位。通过将ORP5-ORP8 PLA与细胞成像软件分析相关联，可以估计ORP5-ORP8复合物与线粒体表面的距离，并确定约50%的ORP5-ORP8 PLA相互作用发生在靠近线粒体的ER亚域。
Introduction
细胞间通讯是真核细胞的一个决定性特征。细胞器交流的一种方式是形成膜接触位点（MCS），这是两个细胞器之间的紧密膜对立，由结构和功能蛋白（如系绳、脂质转移蛋白和钙通道）维持1。MCS可以在相似或不同的细胞器之间建立，它们介导细胞成分的交换，这对于维持细胞稳态很重要。迄今为止，已经鉴定了几种 MCS，包括内质网 （ER）-线粒体、ER-质膜 （PM） 和 ER-脂质液滴 （LD） 接触1。其中，ER和线粒体（MERCSs）之间形成的那些是研究最多的，因为它们参与调节多种细胞功能，包括脂质和钙稳态2。由于线粒体在很大程度上被排除在经典的囊泡运输途径之外，它们依靠MERCS及其分子成分从ER导入关键脂质或脂质前体。这些脂质在MERCS中的非囊泡运输确保了维持适当的线粒体脂质组成，以及它们的功能和结构完整性3。
鉴于MCS在各种细胞功能中的关键参与，在过去几年中，对更深入地了解其分子成分的兴趣大大增加。已经使用了几种基于成像的方法来提高对MCS的了解。其中，基于荧光探针的邻近连接测定法（PLA）已被广泛用作MCS丰度的指标，通过在内源水平4下检测细胞器间蛋白质-蛋白质相互作用（在40nm的检测范围内）。例如，MERCS已经通过使用几个线粒体-ER蛋白对之间的PLA进行可视化和定量，包括VDAC1-IP3R，GRP75-IP3R，CypD-IP3和PTPIP51-VAPB 5,6,7,8。尽管该技术已被用于检测和量化MCS 5,7,9,10,11中存在的细胞器间蛋白质 – 蛋白质相互作用，但大多数研究并未将PLA与细胞器染色相结合。因此，尚未开发出一种定量方法，可以测量PLA相互作用与相关细胞器之间的接近度。因此，到目前为止，在ER蛋白的情况下，它们在与其他细胞器接触的膜亚域内的相互作用尚未与它们在广泛分布的ER网络中的相互作用区分开来。
在这里，我们描述了一种方案，用于检测驻留在同一细胞器膜中的蛋白质之间的PLA相互作用，并分析它们与MCS中伴侣细胞器的膜的接近程度。该协议是基于两个前提开发的：1）先前的研究表明，在过表达条件下，ER脂质转移蛋白ORP5和ORP8在ER-线粒体和ER-PM MCSs 12,13,14,15上共定位和相互作用，ORP5定位在ER-LD接触16,17;2）现有技术，包括PLA，共聚焦显微镜，细胞器标记和3D成像分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议旨在识别和量化MCS的细胞器间蛋白PLA相互作用，特别是在MERCS。该方案的新颖之处在于它将PLA与多个细胞器的标记，共聚焦显微镜和3D图像分析相结合，以定位和量化位于同一膜中的两种蛋白质之间的PLA相互作用，在这种情况下，在ER膜内与线粒体膜（MAM）或同时与MAM和LD非常接近。该协议可用作验证可能定位于特定MERCS的蛋白质的工具，但也可用于其他MCS。
自2006年开发…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了ANR Jeune Chercheur（ANR0015TD），ATIP-Avenir计划，医学研究基金会（n°206548）和Vaincre Alzheimer基金会（eOTP：669122 LS 212527），I’Agence Nationale de la Recherche（ANR-11-EQPX-0029 / Morphoscope，ANR-10-INBS-04 / FranceBioImaging;ANR-11-IDEX-0003-02/萨克雷植物科学）。
Materials
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
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