Visualisierung und Quantifizierung endogener intraorganeller Proteininteraktionen an ER-Mitochondrien-Kontaktstellen durch Proximity-Ligation-Assays
Summary
Der Bedarf an neuen Ansätzen zur Untersuchung von Membrankontaktstellen (MCS) ist aufgrund des zunehmenden Interesses an der Untersuchung dieser zellulären Strukturen und ihrer Komponenten gestiegen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das bisher verfügbare Mikroskopietechnologien integriert, um intra- und interorganelle Proteinkomplexe, die sich an MCS befinden, zu identifizieren und zu quantifizieren.
Abstract
Membrankontaktstellen (MCS) sind Bereiche mit enger Membrannähe, die den dynamischen Austausch verschiedener Biomoleküle (d. h. Kalzium und Lipide) zwischen den nebeneinander liegenden Organellen ermöglichen und regulieren, ohne dass eine Membranfusion erforderlich ist. MCS sind essentiell für die zelluläre Homöostase, und ihre Funktionen werden durch die residenten Komponenten sichergestellt, die oft als multimere Proteinkomplexe vorliegen. MCS betreffen häufig das endoplasmatische Retikulum (ER), einen wichtigen Ort der Lipidsynthese und der zellulären Kalziumspeicherung, und sind besonders wichtig für Organellen wie die Mitochondrien, die von den klassischen vesikulären Transportwegen ausgeschlossen sind. In den letzten Jahren wurden MCS zwischen dem ER und den Mitochondrien ausgiebig untersucht, da ihre Funktionen den zellulären Stoffwechsel/die Bioenergetik stark beeinflussen. An diesen Kontaktstellen wurden mehrere Proteine identifiziert, darunter Membrankabel, Kalziumkanäle und Lipidtransferproteine, was den Bedarf an neuen Methoden und technischen Ansätzen zur Untersuchung dieser MCS-Komponenten erhöht. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das aus kombinierten technischen Ansätzen besteht, die Proximity-Ligations-Assay (PLA), Mitochondrien-Färbung und 3D-Imaging-Segmentierung umfassen, die den Nachweis von Proteinen ermöglicht, die physikalisch nahe beieinander (>40 nm) sind und sich auf derselben Membran an ER-Mitochondrien-MCS befinden. Zum Beispiel haben wir zwei ER-verankerte Lipidtransferproteine, ORP5 und ORP8, verwendet, von denen bereits gezeigt wurde, dass sie an ER-Mitochondrien und ER-Plasmamembran-MCS interagieren und lokalisieren. Durch die Assoziation des ORP5-ORP8 PLA mit der Analyse der Zellbildgebungssoftware war es möglich, den Abstand des ORP5-ORP8-Komplexes von der mitochondrialen Oberfläche abzuschätzen und festzustellen, dass etwa 50% der ORP5-ORP8 PLA-Interaktion an ER-Subdomänen in unmittelbarer Nähe der Mitochondrien stattfindet.
Introduction
Die Kommunikation zwischen den Organellen ist ein wesentliches Merkmal eukaryotischer Zellen. Eine Art und Weise, wie Organellen kommunizieren, ist die Bildung von Membrankontaktstellen (MCSs), bei denen es sich um enge Membranoppositionen zwischen zwei Organellen handelt, die durch strukturelle und funktionelle Proteine wie Haltegurte, Lipidtransferproteine und Kalziumkanäle aufrechterhalten werden1. MCS können zwischen ähnlichen oder unterschiedlichen Organellen etabliert werden und vermitteln den Austausch zellulärer Komponenten, was für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase wichtig ist. Bisher wurden mehrere MCS identifiziert, darunter endoplasmatische Retikula (ER)-Mitochondrien, ER-Plasmamembran (PM) und ER-Lipidtröpfchen (LD)-Kontakte1. Unter ihnen gehören diejenigen, die zwischen dem ER und den Mitochondrien (MERCS) gebildet werden, zu den am besten untersuchten, da sie an der Regulierung mehrerer zellulärer Funktionen beteiligt sind, einschließlich der Lipid- und Kalziumhomöostase2. Da Mitochondrien von den klassischen vesikulären Transportwegen weitgehend ausgeschlossen sind, sind sie auf MERCS und ihre molekularen Bestandteile angewiesen, um Schlüssellipide oder Lipidvorläufer aus dem ER zu importieren. Der nicht-vesikuläre Transport dieser Lipide durch MERCS gewährleistet die Aufrechterhaltung der korrekten Zusammensetzung der mitochondrialen Lipide sowie ihrer funktionellen und strukturellen Integrität3.
Angesichts der entscheidenden Beteiligung von MCS an verschiedenen zellulären Funktionen hat das Interesse an einem tieferen Verständnis ihrer molekularen Bestandteile in den letzten Jahren stark zugenommen. Verschiedene Arten von bildgebenden Ansätzen wurden verwendet, um das Wissen über MCS zu erweitern. Unter ihnen wurde der Fluoreszenzsonden-basierte Proximity-Ligation-Assay (PLA) häufig als Indikator für die Häufigkeit von MCS verwendet, indem er interorganelle Protein-Protein-Wechselwirkungen (in einem Nachweisbereich von 40 nm) auf endogenen Ebenen nachweist4. Zum Beispiel wurden MERCS visualisiert und quantifiziert, indem PLA zwischen mehreren Mitochondrien-ER-Proteinpaaren verwendet wurde, darunter VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 und PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Obwohl diese Technologie verwendet wurde, um interorganelle Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen und zu quantifizieren, die am MCSvorhanden sind 5,7,9,10,11, kombinierten die meisten Studien PLA nicht mit Organellenfärbung. Folglich wurde noch keine quantitative Methode entwickelt, die es ermöglicht, die Nähe zwischen PLA-Wechselwirkungen und assoziierten Organellen zu messen. Bisher wurde daher im Falle von ER-Proteinen ihre Interaktion innerhalb von Membransubdomänen in Kontakt mit anderen Organellen nicht von ihrer Interaktion innerhalb des weit verteilten ER-Netzwerks unterschieden.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Nachweis von PLA-Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die sich in der Membran derselben Organelle befinden, und um ihre Nähe zur Membran der Partnerorganelle am MCS zu analysieren. Dieses Protokoll wurde auf der Grundlage von zwei Prämissen entwickelt: 1) frühere Studien, die zeigen, dass unter Überexpressionsbedingungen die ER-Lipidtransferproteine ORP5 und ORP8 an ER-Mitochondrien und ER-PM MCS 12,13,14,15 kolokalisieren und interagieren und dass ORP5 an ER-LD-Kontakten lokalisiert16,17; 2) bestehende Technologien, einschließlich PLA, konfokale Mikroskopie, Organellenmarkierung und 3D-Bildgebungsanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um interorganelle Protein-PLA-Interaktionen an MCSs, insbesondere an MERCS, zu identifizieren und zu quantifizieren. Die Neuheit des Protokolls besteht darin, dass es PLA mit der Markierung mehrerer Organellen, konfokaler Mikroskopie und 3D-Bildanalyse kombiniert, um PLA-Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen zu lokalisieren und zu quantifizieren, die sich in derselben Membran befinden, in diesem Fall innerhalb der ER-Membran in unmittelbarer Nähe der Membran der Mitochondrien (MAM) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), dem ATIP-Avenir-Programm, der Fondation pour la Recherche Medicale (Nr. 206548) und der Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I’Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences).
Materials
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
References
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