Visualisering og kvantifisering av endogene intraorganelle proteininteraksjoner på ER-mitokondrier kontaktsteder ved nærhetsligeringsanalyser

Summary

Behovet for nye tilnærminger for å studere membrankontaktsteder (MCS) har vokst på grunn av økende interesse for å studere disse cellulære strukturer og deres komponenter. Her presenterer vi en protokoll som integrerer tidligere tilgjengelige mikroskopiteknologier for å identifisere og kvantifisere intraorganelle og interorganelle proteinkomplekser som ligger på MCS.

Abstract

Membrankontaktsteder (MCS) er områder med nær membrannærhet som tillater og regulerer den dynamiske utvekslingen av forskjellige biomolekyler (dvs. kalsium og lipider) mellom de sidestilte organellene uten å involvere membranfusjon. MCS er avgjørende for cellulær homeostase, og deres funksjoner sikres av de bosatte komponentene, som ofte eksisterer som multimere proteinkomplekser. MCS involverer ofte endoplasmatisk retikulum (ER), et viktig sted for lipidsyntese og cellulær kalsiumlagring, og er spesielt viktige for organeller, som mitokondriene, som er utelukket fra de klassiske vesikulære transportveiene. I de siste årene har MCS mellom ER og mitokondrier blitt grundig studert, da deres funksjoner sterkt påvirker cellulær metabolisme / bioenergetikk. Flere proteiner har begynt å bli identifisert på disse kontaktstedene, inkludert membranbånd, kalsiumkanaler og lipidoverføringsproteiner, og øker dermed behovet for nye metoder og tekniske tilnærminger for å studere disse MCS-komponentene. Her beskriver vi en protokoll bestående av kombinerte tekniske tilnærminger, som inkluderer nærhetsligeringsanalyse (PLA), mitokondrierfarging og 3D-bildesegmentering, som gjør det mulig å oppdage proteiner som er fysisk nær (>40 nm) til hverandre og som ligger på samme membran ved ER-mitokondrier MCS. For eksempel brukte vi to ER-forankrede lipidoverføringsproteiner, ORP5 og ORP8, som tidligere har vist seg å interagere og lokalisere ved ER-mitokondrier og ER-plasmamembran MCS. Ved å knytte ORP5-ORP8 PLA til cellebildebehandlingsprogramvareanalyse, var det mulig å estimere avstanden til ORP5-ORP8-komplekset fra mitokondrieoverflaten og bestemme at ca. 50% av ORP5-ORP8 PLA-interaksjonen skjer ved ER-underdomener i nærheten av mitokondrier.

Introduction

Interorganell kommunikasjon er en definerende egenskap for eukaryote celler. En måte organeller kommuniserer på er ved å danne membrankontaktsteder (MCS), som er nære membranopposisjoner mellom to organeller som opprettholdes av strukturelle og funksjonelle proteiner, som tetere, lipidoverføringsproteiner og kalsiumkanaler¹. MCS kan etableres mellom lignende eller forskjellige organeller, og de formidler utvekslingen av cellulære komponenter, noe som er viktig for å opprettholde cellulær homeostase. Hittil har flere MCSer blitt identifisert, inkludert endoplasmatisk retikulum (ER)-mitokondrier, ER-plasmamembran (PM) og ER-lipiddråpe (LD) kontakter¹. Blant dem er de som dannes mellom ER og mitokondriene (MERCS) blant de mest studerte, da de er involvert i reguleringen av flere cellulære funksjoner, inkludert lipid- og kalsiumhomeostase². Siden mitokondrier i stor grad er utelukket fra de klassiske vesikulære transportveiene, er de avhengige av MERCS og deres molekylære bestanddeler for å importere viktige lipider eller lipidforløpere fra ER. Den ikke-vesikulære transporten av disse lipidene over MERCS sikrer opprettholdelse av riktig mitokondriell lipidsammensetning, samt deres funksjonelle og strukturelle integritet³.

Gitt den avgjørende involveringen av MCSer i forskjellige cellulære funksjoner, har interessen for å gi en dypere forståelse av deres molekylære komponenter økt kraftig de siste årene. Flere typer bildebaserte tilnærminger har blitt brukt for å fremme kunnskapen om MCS. Blant dem har fluorescenssondebasert nærhetsligeringsanalyse (PLA) blitt mye brukt som en indikator på overflod av MCSer ved å oppdage interorganelle protein-protein-protein-interaksjoner (i et deteksjonsområde på 40 nm) ved endogene nivåer⁴. For eksempel har MERCS blitt visualisert og kvantifisert ved å bruke PLA mellom flere mitokondrier-ER-proteinpar, inkludert VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 og PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Selv om denne teknologien har blitt brukt til å oppdage og kvantifisere interorganelle protein-protein-interaksjoner som er tilstede ved MCS 5,7,9,10,11^, kombinerte de fleste studiene ikke PLA med organellfarging. Følgelig er det ikke utviklet en kvantitativ metode som gjør det mulig å måle nærheten mellom PLA-interaksjoner og tilhørende organeller ennå. Således, så langt, når det gjelder ER-proteiner, har deres interaksjon i membranunderdomener i kontakt med andre organeller ikke blitt skilt fra deres interaksjon i det vidt distribuerte ER-nettverket.

Her beskriver vi en protokoll for å oppdage PLA-interaksjoner mellom proteiner som ligger i membranen til samme organelle og for å analysere deres nærhet til membranen til partnerorganellen ved MCS. Denne protokollen ble utviklet basert på to premisser: 1) tidligere studier som viser at ER-lipidoverføringsproteinene ORP5 og ORP8 under overekspresjonsbetingelser samlokaliserer og interagerer ved ER-mitokondrier og ER-PM MCSer 12,13,14,15 og at ORP5 lokaliseres ved ER-LD-kontakter ^16,17; 2) eksisterende teknologier, inkludert PLA, konfokalmikroskopi, organellmerking og 3D-bildeanalyse.

Protocol

1. Mitokondriell farging og nærhetsligeringsanalyse (PLA) Plate 0,5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa-celler, vedlikeholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin og 1% ikke-essensielle aminosyrer ved 37 ° C med 5% CO2, i 13 mm glassdeksler i1,5 i 24-brønnsplater ved en fortynning som tillater 75% -90% cellekonfluens på prosedyredagen.MERK: Merk: HeLa-celler kan sendes til ytterligere behandlinger, for eksempel s…

Representative Results

Ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor oppdaget vi interaksjonsstedene til to ER-forankrede lipidoverføringsproteiner, ORP5 og ORP8, og vurderte deres forekomst ved ER-membranunderdomener i kontakt med andre organeller, spesielt med mitokondriene. For det ble mitokondrienettverket i HeLa-celler farget med en rød mitokondriemarkør, og ORP5-ORP8 PLA grønne flekker ble detektert etter fiksering ved bruk av de primære antistoffene anti-ORP5 og anti-ORP8, hvis spesifisitet tidligere ble testet ved immunfluorescens<su…

Discussion

Denne protokollen ble designet for å identifisere og kvantifisere interorganelle protein PLA-interaksjoner ved MCS-er, spesielt ved MERCS-er. Nyheten av protokollen er at den kombinerer PLA med merking av flere organeller, konfokal mikroskopi og 3D-bildeanalyse for å lokalisere og kvantifisere PLA-interaksjoner mellom to proteiner som bor i samme membran, i dette tilfellet innenfor ER-membranen i nærheten av membranen til mitokondrier (MAM) eller med MAM og LD samtidig. Denne protokollen kan brukes som et verktøy for…

Materials

1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)	Gibco	14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl)	VWR	21236.291
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5	Agar Scientific	L46R13-15
CMXRos red MitoTracker	Invitrogen	M7512	red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-X	Leica	DMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates	Merck	CLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma	DUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma	DUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma	DUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	51985026	serum free medium
Imaris software v 9.3	Bitplane	N/A	cell imaging software
Incubator UINCU-line IL10	VWR	390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“)	Knittel Glass
mouse anti-ORP8	Santa Cruz	134409
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
rabbit anti-ORP5	Sigma	HAP038712
Saponin	Sigma	84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free	Invitrogen	10977-035