Настоящее исследование демонстрирует высоковоспроизводимую животную модель острой регионарной ишемии миокарда и реперфузионного повреждения у кроликов, использующих левую мини-торакотомию для случаев выживания или срединную стернотомию для случаев невыживаемости.
Протокол предоставляет простую, легко воспроизводимую методологию индуцирования острой регионарной ишемии миокарда in situ у кролика для экспериментов без выживания и выживания. Новозеландского белого взрослого кролика усыпляют атропином, ацепромазином, буторфанолом и изофлураном. Животное интубируют и помещают на искусственную вентиляцию легких. Внутривенный катетер вводится в краевую ушную вену для инфузии лекарственных препаратов. Животное предварительно лечат гепарином, лидокаином, лактационным раствором Рингера. Срез сонной артерии проводится для получения доступа к артериальному катетеру для мониторинга артериального давления. Выбранные физиологические и механические параметры контролируются и регистрируются с помощью непрерывного анализа в режиме реального времени.
После того, как животное находится под седативным препаратом и под полным наркозом, выполняется либо торакотомия в четвертом межреберье (выживаемость), либо стернотомия по средней линии (невыживаемость). Вскрывается перикард и располагается левая передняя нисходящая артерия.
Полипропиленовый шов пропускается вокруг второй или третьей диагональной ветви артерии LAD, и полипропиленовая нить продевается через небольшую виниловую трубку, образуя петлю. Животное подвергается 30-минутной регионарной ишемии, достигаемой окклюзией LAD путем затягивания силка. Ишемия миокарда подтверждается визуально регионарным цианозом эпикарда. После регионарной ишемии лигатуру ослабляют, и сердцу дают возможность повторной перфузии.
Как в экспериментах с выживаемостью, так и без выживания функция миокарда может быть оценена с помощью эхокардиографии (ЭХО) для измерения фракционного укорочения. Для исследований, не связанных с выживаемостью, данные сономикрометрии, собранные с помощью трех цифровых пьезоэлектрических ультразвуковых зондов, имплантированных в область ишемии, и давление развития левого желудочка (LVDP) с помощью апикально введенного катетера левого желудочка (ЛЖ) могут быть непрерывно получены для оценки региональной и глобальной функции миокарда соответственно.
Для исследований выживаемости разрез закрывают, выполняют торакоцентез левой иглой для эвакуации воздуха из плевры и достигают послеоперационного контроля боли.
Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной смерти в мире и ежегодно приводят к более чем 18 миллионам случаев смерти 1,2,3. Острый инфаркт миокарда (ИМ) является распространенным неотложным состоянием, которое развивается, когда тромб или кусочек атероматозной бляшки блокирует кровоток коронарной артерии. Это вызывает регионарную ишемию миокарда на территории, которую перфузирует артерия.
В настоящем исследовании описывается протокол, который использует простую и надежную методологию для создания острой регионарной ишемии миокарда in situ на кроличьей модели для экспериментов без выживания и выживания. Первоначальная цель этого метода состояла в том, чтобы оценить влияние митохондриальной трансплантации на модуляцию некроза миокарда и повышение постишемической функции сердца после ишемического события. Предыдущие исследования продемонстрировали возникновение митохондриальных изменений и быстрое снижение уровня высокоэнергетических фосфатов после начала ишемии и снижение подачи кислорода, что приводит к резкому уменьшениюзапасов сердечной энергии. Исследователи пытались улучшить постишемическую функцию и уменьшить некроз ткани миокарда с помощью фармакологических вмешательств и/или процедурных методов, но эти методы обеспечивают ограниченную кардиозащиту и оказывают минимальное влияние на повреждение и дисфункцию митохондрий 5,6,7. Наша команда и другие ранее показали, что повреждение митохондрий в основном происходит во время ишемии и что сократительное восстановление может быть усилено, а размер инфаркта миокарда уменьшен с сохранением дыхательной функции митохондрий во время реперфузии 8,9,10. Таким образом, мы предположили, что митохондриальная трансплантация из тканей, не затронутых ишемией, в область ишемии до реперфузии обеспечит альтернативный подход к уменьшению некроза миокарда и усилению функции миокарда. В этой статье мы подробно опишем протокол, используемый для проверки этой теории, и репрезентативные результаты, полученные в результате нашего первоначального анализа исследования.
Кроме того, несколько исследователей сосредоточились на других темах, имеющих важное значение для определения влияния ишемически-реперфузионного повреждения миокарда и разработки соответствующих терапевтических вмешательств. Одной из таких областей исследований является предобусловливание. Прекондиционирование ишемии миокарда является кардиопротекторным механизмом, активируемым кратковременным ишемическим стрессом, который приводит к снижению скорости некроза клеток сердца во время последующих эпизодов длительной ишемии. Эти механизмы могут быть активированы либо гипоксией, либо окклюзией коронарных артерий. Mandel et al. продемонстрировали, что гипоксически-гипероксическое прекондиционирование помогает поддерживать баланс метаболитов оксида азота, снижает гиперпродукцию эндотелина-1 и поддерживает защиту органов11. Кроме того, была исследована концепция дистанционного ишемического прекондиционирования, феномена, при котором прекондиционирование одного органа обеспечивает системную защиту. Ali et al. обнаружили, что у пациентов, перенесших плановую открытую операцию по поводу аневризмы брюшной аорты, дистанционное прекондиционирование, выполняемое путем периодического перекрестного пережатия общей подвздошной артерии в качестве стимула, снижало частоту послеоперационного повреждения миокарда, инфаркта миокарда и почечной недостаточности12.
Кроличьи модели обладают потенциальными преимуществами по сравнению с моделями с другими видами и десятилетиями использовались в различных сценариях, включая индукцию аритмий, глобальные и региональные модели ишемии, а также исследования сердечных сокращений, среди прочих13,14,15. Хотя сердце кролика меньше, чем у собаки или свиньи, оно достаточно большое, чтобы легко выполнять хирургические процедуры с гораздо меньшимизатратами. Часто используется кроличье сердце, так как оно очень похоже на человеческое сердце; Действительно, он имеет аналогичную скорость метаболизма, экспрессирует тяжелую цепь β-миозина и не имеет значительной ксантиноксидазы16 миокарда. Описанный здесь метод индуцирования регионарной ишемии миокарда прост, воспроизводим и экономически эффективен. Этот метод допускает как случаи невыживаемости, так и случаи выживания, поскольку индуцируется только регионарная ишемия, а не глобальная, а необходимые материалы не являются специализированными. Могут быть использованы два различных хирургических подхода (например, стернотомия и мини-торакотомия), что обеспечивает оператору и экспериментальным протоколам большую свободу с точки зрения дизайна исследования. Кроме того, процедура не требует использования искусственного кровообращения. В этом контексте минимально инвазивные подходы к аортокоронарному шунтированию стали ценной альтернативой для пациентов, нуждающихся в многососудистой реваскуляризации17,18. Эта модель может быть использована для изучения различий между этими подходами и предоставления инструмента обучения на животных для стажеров-хирургов. Кроме того, катетеризация сердца с использованием этой модели может быть полезна для физиологических исследований и/или хирургической подготовки.
Наша модель предоставляет методологию для приложений, в которых важно индуцировать регионарную ишемию миокарда и впоследствии измерять размер инфаркта, функцию миокарда и клеточные изменения. С помощью этого протокола мы смогли оценить несколько маркеров клеточной функции и адаптации к ишемии и предлагаемому терапевтическому вмешательству (т.е. митохондриальной трансплантации), изучив интернализацию органелл, потребление кислорода, синтез высокоэнергетических фосфатов и индукцию цитокиновых медиаторов и протеомных путей. Эти результаты важны для сохранения энергетики миокарда, жизнеспособности клеток и функции сердца и позволяют объективно оценить кардиопротекторные методы после ишемически-реперфузионного повреждения. Эта модель может быть использована для изучения аналогичных биологических путей и альтернатив в области постишемической патологии миокарда и восстановления.
Целью данного протокола является предоставление высоковоспроизводимой методологии индуцирования острой регионарной ишемии миокарда in situ у кроликов для экспериментов по невыживанию и выживанию. Эта модель обеспечивает методологию с высокой выживаемостью, низкой интраоперационной летальностью и минимальной заболеваемостью19. Другие модели острой регионарной ишемии миокарда были описаны с использованием радиомеченных материалов, контрастных веществ, магнитно-резонансной томографии или компьютерного моделирования20,21,22. Наш протокол обеспечивает надежную и простую методологию, которая является экономически эффективной, стабильно воспроизводимой и имеет низкие технические требования и, таким образом, может быть выполнена исследователями без хирургического опыта. Этот протокол включает в себя либо проект выживания с использованием левой мини-торакотомии, либо модель без выживания с использованием срединной стернотомии.
Наш протокол демонстрирует надежную методику выполнения острой регионарной ишемии миокарда у кролика. Левосторонняя миниторакотомия идеально подходит для случаев выживания, в которых разрез и связанная с ним боль должны быть сведены к минимуму. Важно отметить, что диуретическая тера…
The authors have nothing to disclose.
Оригинальное исследование, в котором использовался этот протокол, было поддержано грантами Национального института сердца, легких и крови HL-103642 и HL-088206
#10 blade | Bard Parker | 371210 | |
#11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
Bovie | Valleylab | E6008 | |
Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
Clipers | Andis | AGC2 | |
DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
Hot water blanket | 3M | 55577 | |
Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |