Her præsenterer vi en metode til at få billeder af tarmen ved laserinduceret sår. Ved at udsætte musetarmen for en multifotonlaser induceres tabet af en enkelt eller flere krypter lokalt. Ved gentagne gange at afbilde det beskadigede område over måneder fanges realtidsdynamikken i tarmgendannelse.
Undersøgelse af tarmgendannelse in vivo er en udsøgt teknisk udfordring. Mangel på langsgående billeddannelsesprotokoller har forhindret dybere indsigt i celle- og vævsskaladynamikken, der orkestrerer tarmregenerering. Her beskriver vi en intravital mikroskopimetode, der lokalt inducerer vævsskader på enkelt kryptskala og følger tarmepitelets regenerative respons hos levende mus. Enkelte krypter eller større tarmfelter blev ableret af en højintensiv multifoton infrarød laser på en tids- og rumstyret måde. Efterfølgende langvarig gentagen intravital billeddannelse muliggjorde sporing af de beskadigede områder over tid og muliggjorde overvågning af kryptdynamik under vævsgendannelse over en periode på flere uger. Krypt remodeling begivenheder såsom krypt fission, fusion, og forsvinden blev observeret i det nærliggende væv ved laser-induceret skade. Denne protokol muliggør undersøgelse af kryptdynamik både i homeostatiske og patofysiologiske indstillinger, såsom aldring og tumorinitiering.
Tarmens epitelforing udfordres konstant af mavesyrer, toksiner og mikrobiota, der kan forårsage forstyrrelse af epitelbarrieren. Tarmstruktur og vævsorganisation er specialiseret til konstant selvfornyelse og reparation af skader. Tyndtarmens enkeltlags epitel er organiseret i krypt-villus enheder1. I homeostase giver selvfornyende Lgr5+ tarmstamceller, der befinder sig i bunden af krypten, anledning til differentieret afkom. De differentierede datterceller rejser til spidsen af villusaksen på transportbåndsmåde, hvor de kastes, så tarmforingen genopfyldes på 3-5 dage 2,3. På lang sigt bidrager ikke alle Lgr5+-celler lige meget til vævsfornyelsen, da dette også afhænger af cellernes evne til at bevæge sig mod transportbåndet mod kryptens bund (dvs. retrograd bevægelse)4,5. Ved ablation af Lgr5+ celler ved for eksempel stråling bevæger stamceller uden for kryptens bund sig faktisk ind i basen for at dedifferentiere og genopbygge stamcellepuljen 6,7,8.
Akut betændelse kan forårsage tab af Lgr5+ stamceller 9,10. Ud over stamcelletab kan mange eksterne faktorer forårsage akut skade på epitelet på kryptskalaen. Stråling, kemiske behandlinger og antibiotika har vist sig at skade tarmkrypter og villi11. Større felter af krypter og villi kan blive påvirket af bakterielle, virale og parasitære infektioner12. Tarmen har en bemærkelsesværdig evne til at komme sig efter indre og ydre skader på kryptskala ved kryptfission (en opdeling af en krypt i to)13. Ved såret gennemgår krypter i området ved siden af skaden fission for at genopbygge kryptnumrene. Dette fænomen forekommer også, men i mindre grad, under homeostase14,15. For at opveje en potentiel stigning i kryptantallet under homeostase kan krypter også smelte sammen (fusionere to krypter til en)16,17. Hvorvidt kryptfusion også spiller en rolle i genoprettelsen af kryptnumre efter sår er ukendt. Desuden mangler dynamikken og de lovgivningsmæssige faktorer i denne proces stadig at blive belyst.
Skademodeller er uundværlige for at studere vævsregenerering in vivo. Forskellige skademodeller er blevet brugt til at studere tarmvævsregenerering. Tidligere eksperimentelle strategier anvendte højdosisstråling til at nedbryde stamcellepuljer18 eller behandling med dextransulfatnatrium (DSS) for at fremkalde kronisk og akut colitis og krypttab hos mus19,20. Enkeltcelleablation ved genetiske eller optiske midler er blevet brugt til at forfine vævsskade og betragtes som et attraktivt værktøj til at adskille stam- og stamcellers rolle 21,22 og studere vaskulær regenerering23. Derudover er der udviklet et biopsiskadesystem til at fremkalde skader i større felter med flere krypter og villi24. Det er vigtigt, at svaret på den skadelige fornærmelse kan variere langs tarmens proksimale-distale akse, som rapporteret for stråling, hvilket forårsagede mere skade i tyndtarmen end i tyktarmen25. Dette understreger behovet for målrettede metoder, der styrer både omfanget af den skadelige fornærmelse og dens lokalisering i tarmkanalen.
Skadens omfang og helbredelse er traditionelt blevet vurderet ved hjælp af statiske midler, som giver begrænset information om dynamikken i vævsgendannelse. Intravital mikroskopi (IVM) har åbnet unikke muligheder for at kvantificere stamcelleadfærd, epitelremodellering og regenerering i mange organer 26,27,28,29,30 og har givet effektiv indsigt i tarmbiologi 4,5,21,31,32,33,34, 35,36.
Her beskriver vi en metode til at forårsage rumligt tidsmæssigt definerede tarmskader og fange genopretningen af tarmepitelforingen. Vi bruger to fotonbaserede laserablation til at beskadige tarmkrypter og følger det øjeblikkelige sårrespons og langsigtet genopretning ved gentagen intravital mikroskopi. Vores protokol gør det muligt at kortlægge den regenerative remodellering af tarmvævsarkitekturen som reaktion på lokal vævsskade. Kryptdynamik, herunder fissions- og fusionsbegivenheder, kan let kvantificeres og spores over tid. Anvendelsen af laserablation og gentagen intravital billeddannelse kan bruges som en platform til at undersøge vævsskaladynamikken i tarmarkitekturen under homeostase og patofysiologi, såsom tumorinitiering.
Denne protokol kombinerer mikroskopisk laserablation og langsgående intravital mikroskopi for at følge tarmregenerering fra tidlig skaderespons til langsigtet vævsremodellering. Teknikken er etableret i streng overholdelse af etiske overvejelser for at inducere og afbilde mikroskopisk laserablation, og når den følges nøjagtigt, vil den opretholde dyrenes velbefindende. Under operationen er det vigtigt at sikre, at tarmens integritet er godt bevaret. Dette kan opnås ved forsigtigt at håndtere vævet med sterile våde vatpinde, som forhindrer blødning eller udtørring af vævet. Omfanget af laserinduceret mikroskopisk skade bør også vurderes nøje ved at afbilde de forskellige tarmlag i området efter laserablation. Hvis forskeren ønsker at tilpasse hyppigheden af de forsøgstrin, der er beskrevet i denne protokol, bør instituttets dyreetiske komité høres før forsøget for at fastslå konsekvensen for velfærden.
Gentagen intravital mikroskopi gør det muligt at overvåge vævsgendannelse i samme mus over tid. Gentagen kirurgisk eksponering af tarmen giver let optisk adgang til hele tarmkanalen. Vævets iboende egenskaber, såsom vaskulaturen, tjener som landemærker til at identificere de samme tarmområder i hver billeddannelsessession. Således kan det samme vævsområde afbildes over flere uger, hvilket gør det muligt at kvantificere langsigtet vævsregenerering i det samme tarmområde i den samme mus. Den rumlige tidsmæssige kontrol, der tilbydes af den kombinerede kirurgi og billeddannelsesmetode, giver den fordel, at det samme organ kan afbildes under både homeostatiske og regenererende forhold i den samme mus, hvilket står i modsætning til tidligere helorganskademodeller, hvor kontroller og regenererende prøver stammer fra forskellige mus 11,12,18,19,20 . Derfor minimerer vores eksperimentelle indstilling det nødvendige antal dyr, der er nødvendige for eksperimentet, og reducerer variationen inden for dyrene.
Protokolfejlfinding bør starte med en gennemgang af muse- og tarmhåndteringsteknikken og en kontrol af mikroskopiudstyr og indstillinger. Der er mange kritiske trin i denne protokol, der kræver ekstra opmærksomhed. For det første skal alt arbejde udføres i et rent sterilt miljø ved hjælp af aseptisk teknik for at sikre dyrenes trivsel og vedvarende høje datakvalitet, og musetemperaturen skal opretholdes under operationen og hver billeddannelsessession. Det er vigtigt at holde vævet hydreret med sterilt, forvarmet saltvand under billeddannelse og forhindrer vævsfibrose.
For at sikre, at eksperimentet udføres på en reproducerbar måde, er det vigtigt at justere laserne før brug for optimal erhvervelse og at måle multifotonlaserens effekt i begyndelsen af hver session. Parametre som typen af mål, forstørrelse, boligtid, lasereffekt og bølgelængde har indflydelse på omfanget af mikroskopisk laserablation og bør overvejes. I denne undersøgelse udføres både laserablation og billeddannelse med en lasereffekt på 1,2 W (ud af linsen) ved en 960 nm bølgelængde gennem et Fluotar VISIR 25x / 0,95 VANDMÅL. Ændring af bølgelængden eller optiske scanningsegenskaber påvirker omfanget af mikroskopiske skader. En lavere bølgelængde (såsom 840 nm) oversættes til fotoner med højere energi og ofte i et højere output fra laseren og kan øge mikroskopisk skade. En højere zoom resulterer i mere energi pr. region og derfor mindre tid til at ablate krypter og omvendt. Pixelboligtiden kan også øges eller formindskes for at ændre ablationshastigheden og omfanget af skaden. Når det afbildede væv ikke er stabilt (f.eks. På grund af peristaltiske bevægelser), skal ablation udføres hurtigt. Til dette formål bør ablationshastigheden optimeres ved f.eks. at øge zoom- og/eller laseroutputtet.
At finde den samme tarmregion over flere billeddannelsessessioner er et andet kritisk trin, der skal udføres korrekt for at sikre eksperimentets succes. For at gøre dette skal tarmen placeres på nøjagtig samme måde på alle tidspunkter. Vi anbefaler altid at bruge cecum som referencepunkt for at finde de samme regioner i tynd- og tyktarmen. Forsigtigt at strække vævet af interesse med vatpinde sikrer, at interesseområdet er inden for rækkevidde af den objektive arbejdsafstand og maksimerer antallet af regioner, der kan spores tilbage. Derudover anbefaler vi, at du altid ablaterer og afbilder flere mikroskopiske positioner i hver mus for at tage højde for områder, der muligvis ikke er lokaliseret tilbage i en senere billedbehandlingssession. Hvis regionerne ikke kan findes, selvom tarmens placering er korrekt, kan det hjælpe med at omplacere musen og ændre orienteringen af det udsatte område. Sporing af krypter over tid kan være besværligt for eksperimenter, hvor større tarmfelter i flere tilstødende krypter ableres. Sådanne skadelige fornærmelser kan fremkalde vævsombygning ud over epitelmonolaget, hvilket kan kulminere i modifikation af vævsmærkerne, der bruges til sporing af regionen over tid. Valg af landemærker i tilstrækkelig afstand til det beskadigede sted og indfangning af større synsfelter, der overgår det beskadigede område med flere hundrede mikrometer, øger chancen for vellykkede langsigtede eksperimenter. Ud over forkert placering af tarmen på mikroskoptrinnet kan peristaltiske bevægelser i mave-tarmkanalen forstyrre billeddannelsen. Dette problem kan forbedres på to måder. Hvis bevægelsesfrekvensen ikke er for høj, kan processen gentages i samme område med øget eksponeringstid. Alternativt kan højere mængder anæstesi bruges til at mindske peristaltikken. Vi anbefaler, at højere doser isofluran begrænses til korte justeringer. Alt i alt skal billedbehandlingssessionerne holdes så korte som muligt, optimalt under 3 timer, for at sikre hurtig restitution.
Den kombinerede laserablation og langsgående intravital mikroskopi-tilgang har flere fordele sammenlignet med andre skademodeller. Tidligere (kemiske) skadesmodeller manglede evnen til lokalt at begrænse den skadelige fornærmelse 6,11,12,19,20. Laserablation overvinder denne mangel ved at begrænse skaden til et defineret interesseområde. Dette gør det muligt for forskere at kontrollere placeringen af skaden samt skadeomfanget. Skadens sværhedsgrad kan moduleres til ablate krypter eller hele mikroskopiske tarmfelter for at informere om regenerative reaktioner på kryptskalaen. Ud over rumlig kontrol giver laserablation også mulighed for præcist at time skadens begyndelse og derved overgå præcisionen af tidligere lægemiddel-, kemikalie- og infektionsmodeller 9,10,11,12,19,20. Vores protokol udvider tidligere undersøgelser, der brugte laserinduceret termisk ablation som en metode til at fremkalde lokaliseret skade i tarmen21,23. Tidligere laserinducerede skademodeller afbildede lokale områder i tyndtarmen21 eller den luminale overflade af den distale tyktarm23. Den kombinerede kirurgi og laserablationsmetode gør det muligt at visualisere tarmepitelet (især krypter) i høj opløsning og at udføre laserablation og opfølgende billeddannelse af vævsgendannelse i enhver position af tyndtarmen, cecum og proksimal tyktarm. Det fanger genopretningen af de samme tarmområder over tid, hvilket gør det muligt at visualisere forskellige lag af tarmen (slimhinde, submucosa, muscularis og serosa) i henhold til den eksperimentelle opsætning. Vores teknik er hovedsageligt skræddersyet til langvarig gentagen billeddannelse i en periode på flere uger / måneder. For at studere krypters kortsigtede genoprettelsesdynamik (f.eks. i flere på hinanden følgende dage efter skade) kan laserablationsmetoden beskrevet her kombineres med intravitale billeddannelsesvinduer27,28,40.
Denne protokol kan bruges til en lang række forskningsapplikationer fra forskellige videnskabelige områder, der spænder over regenerering, immunologi og kræftforskning. Langsgående billeddannelse af tarmregenerering kaster lys over den cellulære dynamik, der bevarer epitelintegritet og barrierefunktion, muliggør værtsforsvar mod patogener i tarmens lumen, og som ligger til grund for clearance og spredning af onkogene mutationer. Hvert videnskabeligt spørgsmål vil stille unikke krav til omfanget af laserinduceret skade og billeddannelsens varighed. Fluorescerende reportermus og injicerede farvestoffer kan drastisk udvide og forfine de data, der kan erhverves ved at tillade visualisering af enhver celle og struktur af interesse. For eksempel kan en Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti-mus bruges til at visualisere stamcelleafkom, mens Rosa26-mTmG-reporteren informerer om vævsarkitektur. Sammen gør disse nylige teknologiske fremskridt intravitale tarmeksperimenter til et lukrativt værktøj til at fremme vores forståelse af tarmbiologi og sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning NWO (Vici grant 09150182110004 til J.v.R. og Veni grant 09150161910151 til H.A.M.), OCENW. GROOT.2019.085 (til J.v.R) og et EMBO postdoc-stipendium (bevilling ALTF 452-2019 til H.A.M).
Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
Autoclave | Certoclav | ||
Betadine | Mylan | 202809 | |
Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
Ethanol 80% | homemade | NA | |
Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
Imaging box | Custom made | ||
Incision film | Nobafilm | 172215 | |
Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
Micropore paper tape | Micropore | ||
NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
Needle 25G | BD | 300600 | |
Paper tape tesa | Tesa | NA | |
Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |