Enfoque quirúrgico, desafíos y resoluciones para el trasplante de útero en ratas
Summary
El presente protocolo describe todos los pasos esenciales para el éxito del trasplante uterino (UTx) en ratas. El modelo de rata ha demostrado ser adecuado para promover la implementación clínica de UTx; sin embargo, UTx de rata es un procedimiento altamente complejo que requiere instrucciones cuidadosas.
Abstract
El trasplante uterino (UTx) es un nuevo enfoque para tratar a las mujeres con infertilidad absoluta por factor uterino (AUFI). Se estima que entre el 3% y el 5% de las mujeres sufren de AUFI. Estas mujeres fueron privadas de la opción de tener hijos hasta el advenimiento de UTx. La aplicación clínica de UTx fue impulsada por estudios experimentales en animales, y el primer UTx exitoso se logró en ratas. Dadas sus características fisiológicas, inmunológicas, genéticas y reproductivas, las ratas son un sistema modelo adecuado para tales trasplantes. En particular, su corto período de gestación es una clara ventaja, ya que el objetivo habitual de la UTx experimental es el embarazo exitoso con nacidos vivos. El mayor desafío para los modelos de ratas sigue siendo la pequeña anatomía, que requiere habilidades microquirúrgicas avanzadas y experiencia. Aunque UTx ha llevado al embarazo en la clínica, el procedimiento no está establecido y requiere una optimización experimental continua. Aquí, se presenta un protocolo detallado, que incluye la solución de problemas esenciales para UTx de rata, que se espera que haga que todo el procedimiento sea más fácil de comprender para aquellos sin experiencia en este tipo de microcirugía.
Introduction
El trasplante uterino (UTx) es un tratamiento novedoso para la infertilidad por factor uterino absoluto (AUFI). AUFI resulta de una ausencia (congénita o adquirida) o malformación del útero y afecta al 3% -5% de las mujeres en todo el mundo1. Razones éticas, legales o religiosas descartan la adopción o la gestación subrogada para muchas mujeres que tienen un deseo de maternidad pero sufren de AUFI2. Para estas mujeres, UTx sigue siendo la única opción para comenzar su propia familia. UTx se ha aplicado en la clínica, aunque con éxito mixto; El procedimiento es técnicamente desafiante y requiere una mejora constante para su establecimiento clínico.
En 2014, el primer trasplante de útero de una donante viva (LD), que resultó en un embarazo exitoso, fue realizado por el grupo pionero sueco de Brännström3. El primer nacimiento después de UTx de un donante fallecido (DD) fue reportado en 2016 en Brasil4. Para 2021, se han realizado más de 80 UTxs en todo el mundo, sin embargo, con una tasa de éxito de alrededor del 50% y con injertos provenientes de LD para la mayoría1.
Aunque no salva vidas, UTx es un procedimiento cada vez más popular para satisfacer los deseos de su propia progenie. Como tal, la demanda de injertos está aumentando, colocando la donación de DD en un enfoque futuro. Sin embargo, la donación de DD es complicada debido a exposiciones isquémicas considerablemente más prolongadas al frío (y en el caso de muerte cardíaca, también caliente), elevando los riesgos de disfunción y rechazo del injerto 5,6. La técnica quirúrgica, la compatibilidad exigente y la inmunosupresión asociada siguen siendo cuestiones críticas con respecto a los resultados de UTx7.
Para manejar los riesgos anteriores en la clínica, se necesitan modelos animales apropiados para la exploración de la isquemia y la inmunosupresión. El criterio de valoración más relevante clínicamente para los modelos animales sigue siendo el nacimiento exitoso; hasta la fecha, se han logrado embarazos después de UTx experimental en ratones, ratas, ovejas, conejos y monos cynomolgus8. Mientras que los animales más grandes están predestinados para adquirir y optimizar técnicas quirúrgicas, los roedores vienen con la clara ventaja de períodos de gestación cortos. Por lo tanto, los modelos de roedores son superiores en cuanto a consideraciones prácticas, financieras y éticas9. Sin embargo, el principal desafío de UTx en ratones es la pequeña anatomía, con la cirugía altamente exigente vinculada a la baja reproducibilidad de UTxmurino 10. Por el contrario, las ratas son quirúrgicamente más accesibles y conservan las ventajas de los cortos tiempos de gestación. Como tal, la rata se ha convertido en el modelo de elección para UTx9. Wranning et al. introdujeron el modelo de rata de UTx ortotópico en 2008, y usando este modelo, el primer nacimiento vivo después de UTx y apareamiento natural ha sido reportado11,12,13. Estudios posteriores han tenido contribuciones críticas para la implementación de UTx en humanos9.
No obstante, UTx sigue siendo un desafío en ratas, y solo unos pocos grupos hasta ahora han dominado esta técnica quirúrgica. Un obstáculo relevante para la propagación de UTx en ratas entre los investigadores es la falta de una descripción precisa de los pasos microquirúrgicos individuales, las trampas y las medidas correspondientes para la resolución de problemas14. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una guía detallada para este procedimiento microquirúrgico altamente complejo para facilitar la implementación de este modelo animal en futuras investigaciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí ofrece instrucciones detalladas para el enfoque quirúrgico detrás del trasplante de útero en ratas. El protocolo ha sido optimizado para aumentar las probabilidades de nacimientos vivos después de UTx y posterior apareamiento. El protocolo original ha sido tomado del grupo Brännström 12,13, inspirado en el trabajo con ratones de Akouri et al.10, y modificado en base a las experiencias de los autores en los últimos años.<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (subvención del proyecto no. 310030_192736). Nos gustaría agradecer a la Dra. Frauke Seehusen del Instituto de Patología Veterinaria de la Universidad de Zurich por su apoyo histopatológico.
Materials
| Angled to Side Scissor 5 mm | F.S.T | 15008-08 | |
| Big Paper Clip | No specific | Used as retractor | |
| Blunt Bend Needle G30 | Unimed S.A. | ||
| Bupivacain 0.5% | Sintetica | ||
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Temgesic | ||
| Dosiernadel G25 | H.SIGRIST& PARTNER AG | ||
| Dumont #5SF Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Ethilon 10/0 | Ethicon | 2810G | |
| Ethilon 6/0 | Ethicon | 667H | |
| Ethilon 7/0 | Ethicon | EH7446H | |
| Ethilon 8/0 | Ethicon | 2808G | |
| Femal Brown Norway Rats (150-170 g) | Janvier | ||
| Femal Lewis Rats (150-170 g) | Charles River Deutschland | ||
| Fine Scissors – Sharp | F.S.T | 14060-09 | Any other small scissor works too |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | Any other small needholder works too |
| Heparin Natrium 25000 I.E./ 5 mL | B. Braun | ||
| Institute Georges Lopez Perfusion Solution (IGL) | Institute Georges Lopez | Organ preservation solution | |
| Male Lewis Rats (300-320 g) | Charles River Deutschland | ||
| Micro Serrefines 13 mm | F.S.T | 18055-04 | |
| Micro Serrefines 16 mm gebogen | F.S.T | 18055-06 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | |
| Mölnlyncke Op Towel | Mölnlyncke | 800300 | Sterile drape |
| NaCl 0.9% | B.Braun | ||
| Octenisept | Schülke | ||
| Paper Tape | Tesa | For fixing the animal | |
| Philips Avent Schneller Flaschenwärmer SCF358/02 | Philips | 12824216 | |
| Ringerfundin | B.Braun | ||
| Rompun 2% | Bayer | Xylazine | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| S&T Vessel Dilating Forceps – Angled 45° | F.S.T | 00276-13 | |
| Sacryl Naht | KRUUSE | 152575 | |
| Scapel No 10 | Swann Morton | 201 | |
| Small Histo-Container | Any small histo-container works fine-for coldstorage of the graft | ||
| Small Plastik Bags | Any transparant plastic bags are fine | ||
| Steril Cotton swab | Lohmann-Rauscher | Any steril cotton swab is fine | |
| Sterile Gauze | Lohmann-Rauscher | Any steril gauze is fine | |
| Straight Scissor 8mm | F.S.T | 15024-10 | |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | OLY-SZX9-B | |
| Sutter Non Stick GLISS 0.4 mm | Sutter | 78 01 69 SLS | |
| Suture Tying Forceps | F.S.T | 00272-13 | |
| ThermoLux warming mat | ThermoLux | ||
| Tissue Forceps for Skin | Any tissue forceps are fine | ||
| Vesseldilatator Forceps | F.S.T | 00125-11 | |
| Vicryl plus 4/0 | Ethicon | VCP292H |
References
- Richards, E. G., et al. Uterus transplantation: state of the art in 2021. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2251-2259 (2021).
- Jones, B. P., et al. Options for acquiring motherhood in absolute uterine factor infertility; adoption, surrogacy and uterine transplantation. The Obstetrician & Gynaecologist. 23 (2), 138-147 (2021).
- Brannstrom, M., et al. The first clinical trial of uterus transplantation: surgical technique and outcome. American Journal of Transplantation. 14, 44 (2014).
- Ejzenberg, D., et al. Livebirth after uterus transplantation from a deceased donor in a recipient with uterine infertility. Lancet. 392 (10165), 2697-2704 (2018).
- Lavoue, V., et al. Which donor for uterus transplants: brain-dead donor or living donor? A systematic review. Transplantation. 101 (2), 267-273 (2017).
- O’Donovan, L., Williams, N. J., Wilkinson, S. Ethical and policy issues raised by uterus transplants. British Medical Bulletin. 131 (1), 19-28 (2019).
- Kisu, I., et al. Long-term outcome and rejection after allogeneic uterus transplantation in cynomolgus macaques. Journal of Clinical Medicine. 8 (10), 1572 (2019).
- Ozkan, O., et al. Uterus transplantation: From animal models through the first heart beating pregnancy to the first human live birth. Womens Health. 12 (4), 442-449 (2016).
- Favre-Inhofer, A., et al. Involving animal models in uterine transplantation. Frontiers in Surgery. 9, 830826 (2022).
- El-Akouri, R. R., Wranning, C. A., Molne, J., Kurlberg, G., Brannstrom, M. Pregnancy in transplanted mouse uterus after long-term cold ischaemic preservation. Human Reproduction. 18 (10), 2024-2030 (2003).
- Sahin, S., Selcuk, S., Eroglu, M., Karateke, A. Uterus transplantation: Experimental animal models and recent experience in humans. Turkish Journal of Obstetrics and Gynecology. 12 (1), 38-42 (2015).
- Wranning, C. A., Akhi, S. N., Diaz-Garcia, C., Brannstrom, M. Pregnancy after syngeneic uterus transplantation and spontaneous mating in the rat. Human Reproduction. 26 (3), 553-558 (2011).
- Wranning, C. A., Akhi, S. N., Kurlberg, G., Brannstrom, M. Uterus transplantation in the rat: Model development, surgical learning and morphological evaluation of healing. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 87 (11), 1239-1247 (2008).
- Brannstrom, M., Wranning, C. A., Altchek, A. Experimental uterus transplantation. Human Reproduction Update. 16 (3), 329-345 (2010).
- Diaz-Garcia, C., Akhi, S. N., Wallin, A., Pellicer, A., Brannstrom, M. First report on fertility after allogeneic uterus transplantation. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 89 (11), 1491-1494 (2010).
- R, E., Brown, M. J., Karas, A. Z. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2nd edn. , (2008).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols. , 8 (2006).
- Rutledge, C., Raper, D. M. S., Abla, A. A. How I do it: superficial temporal artery-middle cerebral artery bypass for flow augmentation and replacement. Acta Neurochirurgica. 162 (8), 1847-1851 (2020).
- Kuo, S. C. -. H., et al. The multiple-U technique: a novel microvascular anastomosis technique that guarantees everted anastomosis sites with solid intima-to-intima contact. Plastic and Reconstructive Surgery. 149 (5), 981 (2022).
- Magee, D. J., Manske, R. C. . Pathology and Intervention in Musculoskeletal Rehabilitation. 2nd edn. , 25-62 (2016).
- Diaz-Garcia, C., Johannesson, L., Shao, R. J., Bilig, H., Brannstrom, M. Pregnancy after allogeneic uterus transplantation in the rat: perinatal outcome and growth trajectory. Fertility and Sterility. 102 (6), 1545-1552 (2014).
- Canovai, E., et al. IGL-1 as a preservation solution in intestinal transplantation: a multicenter experience. Transplant International. 33 (8), 963-965 (2020).
- Habran, M., De Beule, J., Jochmans, I. IGL-1 preservation solution in kidney and pancreas transplantation: A systematic review. PLoS One. 15 (4), 0231019 (2020).
- Mosbah, I. B., et al. IGL-1 solution reduces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in rat liver transplantation. Cell Death & Disease. 3 (3), 279 (2012).
- Wiederkehr, J. C., et al. Use of IGL-1 preservation solution in liver transplantation. Transplantation Proceedings. 46 (6), 1809-1811 (2014).
- Tilney, N. L., Guttmann, R. D. Effects of initial ischemia/reperfusion injury on the transplanted kidney. Transplantation. 64 (7), 945-947 (1997).
- de Rougemont, O., Dutkowski, P., Clavien, P. A. Biological modulation of liver ischemia-reperfusion injury. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (2), 183-189 (2010).
- Jakubauskiene, L., et al. Relaxin and erythropoietin significantly reduce uterine tissue damage during experimental ischemia-reperfusion injury. International Journal of Molecular Sciences. 23 (13), 7120 (2022).
- Wang, Y., Wu, Y., Peng, S. Resveratrol inhibits the inflammatory response and oxidative stress induced by uterine ischemia reperfusion injury by activating PI3K-AKT pathway. PLoS One. 17 (6), 0266961 (2022).
- Kisu, I., et al. Risks for donors in uterus transplantation. Reproductive Sciences. 20 (12), 1406-1415 (2013).
- Jones, B. P., et al. Uterine transplantation in transgender women. BJOG: an International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 126 (2), 152-156 (2019).
