विवो प्लेसेंटल लक्षित CRISPR हेरफेर में माउस
Summary
यहां हम विवो में माउस प्लेसेंटा में महत्वपूर्ण विकास मार्गों में प्रभावी ढंग से हेरफेर करने के लिए एक समय-विशिष्ट विधि का वर्णन करते हैं। यह भ्रूण के दिन 12.5 पर गर्भवती बांधों के प्लेसेंटा में सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड के इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से किया जाता है।
Abstract
प्लेसेंटा एक आवश्यक अंग है जो गर्भाशय में स्तनधारी विकास को नियंत्रित और बनाए रखता है। प्लेसेंटा मां और भ्रूण के बीच पोषक तत्वों और कचरे के हस्तांतरण और विकास कारकों और हार्मोन के उत्पादन और वितरण के लिए जिम्मेदार है। प्रसवपूर्व विकास में प्लेसेंटा की विशिष्ट भूमिका को समझने के लिए चूहों में प्लेसेंटल आनुवंशिक जोड़तोड़ महत्वपूर्ण हैं। प्लेसेंटल-विशिष्ट क्रे-व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों की अलग-अलग प्रभावशीलता होती है, और प्लेसेंटल जीन हेरफेर के लिए अन्य तरीके उपयोगी विकल्प हो सकते हैं। यह पेपर सीआरआईएसपीआर जीन हेरफेर का उपयोग करके प्लेसेंटल जीन अभिव्यक्ति को सीधे बदलने की तकनीक का वर्णन करता है, जिसका उपयोग लक्षित जीन की अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए किया जा सकता है। अपेक्षाकृत उन्नत शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, गर्भवती बांधों को भ्रूण के दिन 12.5 (ई 12.5) पर लैप्रोटॉमी से गुजरना पड़ता है, और एक सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड को एक ग्लास माइक्रोपिपेट द्वारा व्यक्तिगत प्लेसेंटा में पहुंचाया जाता है। प्रत्येक इंजेक्शन के तुरंत बाद प्लास्मिड को इलेक्ट्रोपोरेट किया जाता है। बांध की वसूली के बाद, प्लेसेंटा और भ्रूण बाद के समय में मूल्यांकन तक विकास जारी रख सकते हैं। इस तकनीक के उपयोग के बाद प्लेसेंटा और संतान ों का मूल्यांकन विकास में समय-विशिष्ट प्लेसेंटल फ़ंक्शन की भूमिका निर्धारित कर सकता है। इस प्रकार का हेरफेर इस बात की बेहतर समझ के लिए अनुमति देगा कि प्लेसेंटल जेनेटिक्स और फ़ंक्शन कई रोग संदर्भों में भ्रूण के विकास और विकास को कैसे प्रभावित करते हैं।
Introduction
प्लेसेंटा भ्रूण के विकास में शामिल एक आवश्यक अंग है। प्लेसेंटा की मुख्य भूमिका आवश्यक कारक प्रदान करना और भ्रूण से पोषक तत्वों और कचरे के हस्तांतरण को विनियमित करना है। स्तनधारी प्लेसेंटा भ्रूण और मातृ ऊतक दोनों से बने होते हैं, जो भ्रूण-मातृ इंटरफ़ेस बनाते हैं, और इस प्रकार, मां और भ्रूण दोनों के आनुवंशिकी कार्य कोप्रभावित करते हैं। आनुवंशिक विसंगतियां या प्लेसेंटा का बिगड़ा हुआ कार्य भ्रूण के विकास को काफी बदल सकता है। पिछले काम से पता चला है कि प्लेसेंटल जेनेटिक्स और विकास भ्रूण में विशिष्ट अंग प्रणालियों के परिवर्तित विकास से जुड़े हैं। विशेष रूप से, प्लेसेंटा में असामान्यताएं भ्रूण के मस्तिष्क, हृदय और संवहनी प्रणाली 2,3,4,5 में परिवर्तन से जुड़ी हुई हैं।
गर्भनाल से भ्रूण तक हार्मोन, विकास कारक और अन्य अणुओं का परिवहन भ्रूणके विकास में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। यह दिखाया गया है कि विशिष्ट अणुओं के प्लेसेंटल उत्पादन को बदलने से न्यूरोडेवलपमेंट बदल सकता है। मातृ सूजन प्लेसेंटा में ट्रिप्टोफैन (टीआरपी) चयापचय जीन अभिव्यक्ति को बदलकर सेरोटोनिन के उत्पादन को बढ़ा सकती है, जो बाद में भ्रूणके मस्तिष्क में सेरोटोनिन का संचय बनाती है। अन्य अध्ययनों में हृदय दोषों के साथ प्लेसेंटल असामान्यताएं पाई गई हैं। प्लेसेंटा में असामान्यताओं को जन्मजात हृदय दोषों में योगदान करने के लिए माना जाता है, जो मनुष्यों में सबसे आम जन्म दोषहै। हाल के एक अध्ययन ने कई जीनों की पहचान की है जिनके प्लेसेंटा और हृदय दोनों में समान सेलुलर मार्ग हैं। यदि बाधित होता है, तो ये मार्ग दोनों अंगों में दोष पैदा करसकते हैं। प्लेसेंटा में दोष जन्मजात हृदय दोषों को बढ़ा सकते हैं। विशिष्ट भ्रूण अंग प्रणाली के विकास पर प्लेसेंटल जेनेटिक्स और फ़ंक्शन की भूमिका अध्ययन का एक उभरता हुआ क्षेत्र है।
चूहों में हेमोकोरियल प्लेसेंटा और मानव प्लेसेंटा की अन्य विशेषताएं होती हैं, जो उन्हें मानव रोग1 का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक उपयोगी मॉडल बनाती हैं। प्लेसेंटा के महत्व के बावजूद, वर्तमान में विवो आनुवंशिक जोड़तोड़ में लक्षित की कमी है। इसके अलावा, प्लेसेंटा10 में ओवरएक्प्रेशन या गेन-ऑफ-फंक्शन जोड़तोड़ की तुलना में नॉकआउट या वध के लिए वर्तमान में अधिक विकल्प उपलब्ध हैं। प्लेसेंटल-विशिष्ट हेरफेर के लिए कई ट्रांसजेनिक क्रे-व्यक्त लाइनें हैं, प्रत्येक अलग-अलग समय बिंदुओं पर अलग-अलग ट्रोफोब्लास्ट वंशावली में। इनमें Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRa-CreER, और Gcm1-Cre 11,12,13,14 शामिल हैं। जबकि ये क्रे ट्रांसजेन कुशल हैं, वे विशिष्ट समय बिंदुओं पर कुछ जीनों में हेरफेर करने में सक्षम नहीं हो सकते हैं। प्लेसेंटल जीन अभिव्यक्ति को नॉकआउट या ओवरएक्सप्रेस करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली एक और विधि ब्लास्टोसिस्ट संस्कृति में लेंटिवायरल वैक्टर का सम्मिलन है, जो ट्रोफोब्लास्ट-विशिष्ट आनुवंशिक हेरफेर15,16 का कारण बनता है। यह तकनीक विकास में प्लेसेंटल जीन अभिव्यक्ति में एक मजबूत बदलाव की अनुमति देती है। विवो में आरएनए हस्तक्षेप का उपयोग प्लेसेंटा में विरल रूप से उपयोग किया गया है। एसएचआरएनए प्लास्मिड का सम्मिलन इस पेपर में वर्णित सीआरआईपीएसआर तकनीक के समान किया जा सकता है। यह प्लेसेंटा में पीएलजीएफ अभिव्यक्ति को सफलतापूर्वक कम करने के लिए ई 13.5 पर किया गया है, जिसमें संतान मस्तिष्क वाहिका17 पर प्रभाव पड़ता है।
मुख्य रूप से नॉकआउट या वध के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकों के अलावा, उत्प्रेरण अतिवृद्धि आमतौर पर एडेनोवायरस या बहिर्जात प्रोटीन के सम्मिलन के साथ की जाती है। ओवरएक्प्रेशन के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकों में सफलता की दर अलग-अलग होती है और ज्यादातर गर्भावस्था में बाद में प्रदर्शन किया जाता है। प्लेसेंटल फ़ंक्शन में इंसुलिन जैसे विकास कारक 1 (आईजीएफ -1) की भूमिका की जांच करने के लिए, आईजीएफ -1 जीन18,19 के ओवरएक्प्रेशन को प्रेरित करने के लिए एक एडेनोवायरल-मध्यस्थता प्लेसेंटल जीन ट्रांसफर किया गया था। यह सीधे प्लेसेंटल इंजेक्शन के माध्यम से ई 18.5 पर माउस गर्भधारण में देर से किया गया था। अतिरिक्त विकल्प प्रदान करने और स्थापित प्लेसेंटल आनुवंशिक जोड़तोड़ की संभावित विफलताओं को दरकिनार करने के लिए, जैसे कि क्रे-लॉक्स संयोजन विफलताएं, एडेनोवायरस की संभावित विषाक्तता, और एसएचआरएनए के ऑफ-टारगेट प्रभाव, प्लेसेंटा के विवो डायरेक्ट सीआरआईएसपीआर हेरफेर में20,21,22 का उपयोग किया जा सकता है। यह मॉडल ओवरएक्प्रेशन मॉडल की कमी को दूर करने और लचीलेपन के साथ एक मॉडल बनाने के लिए विकसित किया गया था।
यह तकनीक लेक्यूयर एट अल के काम पर आधारित है, जिसमें पीएलजीएफ अभिव्यक्ति17 को बदलने के लिए एसएचआरएनए और सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड को सीधे विवो से माउस प्लेसेंटा में लक्षित किया गया था। इस तकनीक का उपयोग कई समय बिंदुओं पर सीआरआईएसपीआर हेरफेर का उपयोग करके प्लेसेंटल जीन अभिव्यक्ति को सीधे बदलने के लिए किया जा सकता है; इस काम के लिए, E12.5 का चयन किया गया था। प्लेसेंटा इस बिंदु तक परिपक्व हो गया है और हेरफेर करने के लिए काफी बड़ा है, जिससे ई 12.5 पर एक विशिष्ट सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड के सम्मिलन की अनुमति मिलती है, जो मध्य से देर तक गर्भावस्था23,24 तक भ्रूण के विकास पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है। ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण के विपरीत, लेकिन वायरल प्रेरण या आरएनए हस्तक्षेप के समान, यह तकनीक अपेक्षाकृत उन्नत शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण का उपयोग करके विशेष समय बिंदुओं पर ओवरएक्प्रेशन या नॉकआउट की अनुमति देती है, इस प्रकार पहले के परिवर्तनों से संभावित बिगड़ा हुआ प्लेसेंटाशन या भ्रूण घातकता से बचती है। चूंकि केवल कुछ प्लेसेंटा एक कूड़े के भीतर प्रयोगात्मक या नियंत्रण प्लास्मिड प्राप्त करते हैं, इसलिए दृष्टिकोण दो प्रकार के आंतरिक नियंत्रणों की अनुमति देता है। ये नियंत्रण वे हैं जिन्हें उचित नियंत्रण प्लास्मिड के साथ इंजेक्ट और इलेक्ट्रोपोरेट किया जाता है और जिन्हें कोई प्रत्यक्ष हेरफेर नहीं मिलता है। इस तकनीक को एक सहक्रियात्मक सक्रियण मध्यस्थ (एसएएम) सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड के माध्यम से माउस प्लेसेंटा में आईजीएफ -1 जीन के ओवरएक्प्रेशन बनाने के लिए अनुकूलित किया गया था। IGF-1 जीन को चुना गया था, क्योंकि IGF-1 भ्रूण को दिया जाने वाला एक आवश्यक विकास हार्मोन है जो मुख्य रूप से जन्मसे पहले प्लेसेंटा में उत्पन्न होता है। यह नई प्लेसेंटल-लक्षित सीआरआईएसपीआर तकनीक प्लेसेंटल फ़ंक्शन और भ्रूण के विकास के बीच संबंध को परिभाषित करने में मदद करने के लिए प्रत्यक्ष हेरफेर की अनुमति देगी।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्लेसेंटा भ्रूण के विकास का एक प्राथमिक नियामक है, और जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, प्लेसेंटल जीन अभिव्यक्ति या कार्य में परिवर्तन भ्रूण के विकासको काफी प्रभावित कर सकता है। यहां उल्लिखित ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक निम्नलिखित वित्त पोषण स्रोतों को स्वीकार करते हैं: R01 MH122435, NIH T32GM008629, और NIH T32GM145441। लेखक ों ने आयोवा विश्वविद्यालय में डॉ वैल शेफ़ील्ड और डॉ केल्विन कार्टर की प्रयोगशालाओं को उनके सर्जरी कक्ष और उपकरणों के उपयोग के लिए धन्यवाद दिया, साथ ही डॉ एरिक वैन ओटरलू, डॉ नंदकुमार नारायणन और डॉ मैथ्यू वेबर को माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी सहायता के लिए धन्यवाद दिया। लेखक ों ने पायलट सर्जरी के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ सारा मौरर, माया इवांस और श्रीलेखा कुंडू को भी धन्यवाद दिया।
Materials
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD – Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 – 44 – 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂ |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24×60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD – Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
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