Summary
Qui descriviamo un metodo specifico del tempo per manipolare efficacemente i percorsi di sviluppo critici nella placenta del topo in vivo. Questo viene eseguito attraverso l'iniezione e l'elettroporazione di plasmidi CRISPR nelle placente di madri gravide il giorno embrionale 12.5.
Abstract
La placenta è un organo essenziale che regola e mantiene lo sviluppo dei mammiferi in utero. La placenta è responsabile del trasferimento di nutrienti e rifiuti tra la madre e il feto e della produzione e consegna di fattori di crescita e ormoni. Le manipolazioni genetiche placentari nei topi sono fondamentali per comprendere il ruolo specifico della placenta nello sviluppo prenatale. I topi transgenici che esprimono Cre specifici per la placenta hanno un'efficacia variabile e altri metodi per la manipolazione genica placentare possono essere alternative utili. Questo articolo descrive una tecnica per alterare direttamente l'espressione genica placentare utilizzando la manipolazione genica CRISPR, che può essere utilizzata per modificare l'espressione di geni mirati. Utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato, le madri gravide subiscono una laparotomia al giorno embrionale 12.5 (E12.5) e un plasmide CRISPR viene somministrato da una micropipetta di vetro nelle singole placente. Il plasmide viene immediatamente elettroporato dopo ogni iniezione. Dopo il recupero della madre, la placenta e gli embrioni possono continuare lo sviluppo fino alla valutazione in un secondo momento. La valutazione della placenta e della prole dopo l'uso di questa tecnica può determinare il ruolo della funzione placentare specifica del tempo nello sviluppo. Questo tipo di manipolazione consentirà una migliore comprensione di come la genetica e la funzione placentare influenzano la crescita e lo sviluppo fetale in più contesti patologici.
Introduction
La placenta è un organo essenziale coinvolto nello sviluppo del feto. Il ruolo principale della placenta è quello di fornire fattori essenziali e regolare il trasferimento di nutrienti e rifiuti da e verso il feto. Le placente dei mammiferi sono composte da tessuto fetale e materno, che costituiscono l'interfaccia fetale-materna e, quindi, la genetica della madre e del feto influisce sulla funzione1. Anomalie genetiche o compromissione della funzione della placenta possono alterare drasticamente lo sviluppo fetale. Lavori precedenti hanno dimostrato che la genetica e lo sviluppo placentare sono associati allo sviluppo alterato di specifici sistemi di organi nel feto. In particolare, le anomalie nella placenta sono legate a cambiamenti nel cervello fetale, nel cuore e nel sistema vascolare 2,3,4,5.
Il trasporto di ormoni, fattori di crescita e altre molecole dalla placenta al feto svolge un ruolo importante nello sviluppo fetale6. È stato dimostrato che alterare la produzione placentare di molecole specifiche può alterare lo sviluppo neurologico. L'infiammazione materna può aumentare la produzione di serotonina alterando l'espressione genica metabolica del triptofano (TRP) nella placenta, che successivamente crea un accumulo di serotonina nel cervello fetale7. Altri studi hanno trovato anomalie placentari accanto a difetti cardiaci. Si ritiene che le anomalie nella placenta contribuiscano a difetti cardiaci congeniti, il difetto alla nascita più comune negli esseri umani8. Uno studio recente ha identificato diversi geni che hanno percorsi cellulari simili sia nella placenta che nel cuore. Se interrotti, questi percorsi potrebbero causare difetti in entrambi gli organi9. I difetti nella placenta possono esacerbare i difetti cardiaci congeniti. Il ruolo della genetica e della funzione placentare sullo sviluppo di specifici sistemi di organi fetali è un campo di studio emergente.
I topi hanno placente emocoriali e altre caratteristiche delle placente umane, il che li rende modelli molto utili per lo studio delle malattie umane1. Nonostante l'importanza della placenta, attualmente mancano manipolazioni genetiche mirate in vivo. Inoltre, ci sono attualmente più opzioni disponibili per knockout o knockdown rispetto alla sovraespressione o alle manipolazioni di guadagno di funzione nella placenta10. Esistono diverse linee transgeniche che esprimono il Cre per la manipolazione placentare-specifica, ognuna in diversi lignaggi di trofoblasti in diversi punti temporali. Questi includono Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER, e Gcm1-Cre 11,12,13,14. Mentre questi transgeni Cre sono efficienti, potrebbero non essere in grado di manipolare alcuni geni in punti temporali specifici. Un altro metodo comunemente usato per eliminare o sovraesprimere l'espressione genica placentare è l'inserimento di vettori lentivirali nella coltura di blastocisti, che causa una manipolazione genetica specifica del trofoblasto15,16. Questa tecnica consente un robusto cambiamento nell'espressione genica placentare nelle prime fasi dello sviluppo. L'uso dell'interferenza dell'RNA in vivo è stato scarsamente utilizzato nella placenta. L'inserimento di plasmidi shRNA può essere eseguito in modo simile alla tecnica CRIPSR descritta in questo articolo. Questo è stato fatto a E13.5 per ridurre con successo l'espressione di PlGF nella placenta, con impatti sulla vascolarizzazione cerebrale della prole17.
Oltre alle tecniche utilizzate principalmente per knockout o knockdown, l'induzione della sovraespressione viene comunemente eseguita con adenovirus o l'inserimento di una proteina esogena. Le tecniche utilizzate per la sovraespressione hanno tassi variabili di successo e sono state per lo più eseguite più tardi nella gestazione. Per studiare il ruolo del fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1) nella funzione placentare, è stato eseguito un trasferimento genico placentare adenovirale-mediato per indurre la sovraespressione del gene IGF-1 18,19. Questo è stato eseguito tardi nella gestazione del topo su E18.5 tramite iniezione placentare diretta. Per fornire ulteriori opzioni e aggirare possibili fallimenti di manipolazioni genetiche placentari stabilite, come i fallimenti della combinazione Cre-Lox, la possibile tossicità degli adenovirus e gli effetti off-target dello shRNA, è possibile utilizzare la manipolazione diretta CRISPR in vivo della placenta20,21,22. Questo modello è stato sviluppato per ovviare alla mancanza di modelli di sovraespressione e per creare un modello con flessibilità.
Questa tecnica si basa sul lavoro di Lecuyer et al., in cui i plasmidi shRNA e CRISPR sono stati mirati direttamente in vivo alle placente di topo per alterare l'espressione di PlGF 17. Questa tecnica può essere utilizzata per alterare direttamente l'espressione genica placentare utilizzando la manipolazione CRISPR in più punti temporali; per questo lavoro è stato selezionato E12.5. La placenta è maturata a questo punto ed è abbastanza grande da manipolare, consentendo l'inserimento di uno specifico plasmide CRISPR su E12.5, che può avere un impatto significativo sullo sviluppo fetale da metà a fine gravidanza23,24. A differenza degli approcci transgenici, ma simile alle induzioni virali o all'interferenza dell'RNA, questa tecnica consente la sovraespressione o il knockout in particolari punti temporali utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato, evitando così possibili compromissione della placentazione o letalità embrionale da cambiamenti precedenti. Poiché solo poche placente ricevono il plasmide sperimentale o di controllo all'interno di una cucciolata, l'approccio consente due tipi di controlli interni. Questi controlli sono quelli iniettati ed elettroporati con il plasmide di controllo appropriato e quelli che non ricevono alcuna manipolazione diretta. Questa tecnica è stata ottimizzata per creare una sovraespressione del gene IGF-1 nella placenta del topo tramite un plasmide CRISPR mediatore di attivazione sinergica (SAM). È stato scelto il gene IGF-1, poiché IGF-1 è un ormone della crescita essenziale consegnato al feto che viene prodotto principalmente nella placenta prima della nascita25,26. Questa nuova tecnica CRISPR mirata alla placenta consentirà la manipolazione diretta per aiutare a definire la connessione tra la funzione placentare e lo sviluppo fetale.
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità e conformità con le normative federali e la politica dell'Università dell'Iowa e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
1. Animali e allevamento
- Tenere gli animali in un ciclo di luce diurna di 12 ore con cibo e acqua ad libitum.
- Utilizzare topi femmina CD-1 di età compresa tra 8 e 15 settimane. Utilizzare la presenza di un tappo copulatore per identificare E0.5.
- Su E0.5, ospitare singolarmente le madri gravide.
2. Taratura della micropipetta
NOTA: la calibrazione della micropipetta deve essere eseguita prima dell'intervento chirurgico, quando possibile.
- Prima di realizzare e calibrare la micropipetta, diluire tutti i plasmidi alla concentrazione raccomandata (0,1 μg/μL) in acqua priva di DNasi. Mescolare il plasmide con colorante Fast Green opportunamente diluito (1 μg/μL in PBS) (concentrazione plasmidica finale: 0,06 μg/μL).
- Tirare micropipette utilizzando capillari di vetro da 10 cm con un diametro esterno di 1,5 mm e un diametro interno di 0,86 mm con un estrattore di micropipette.
- Rompere con cura la punta di una micropipetta (2-3 mm) con una pinza sterile.
- Caricare la micropipetta in una punta microcapillare collegata a un microiniettore. Assicurarsi che il microiniettore sia collegato alla macchina di microiniezione e che vi siano livelli sufficienti di azoto per calibrare la micropipetta.
- Una volta che la micropipetta è collegata al microiniettore, caricarla con la soluzione di colorante Fast Green per eseguire la calibrazione (1 μg/μL in PBS). Calibrare la micropipetta per iniettare un volume di circa 3,5 μL. Svuotare ("trasparente") la micropipetta in preparazione per caricare le soluzioni plasmidiche come di seguito.
NOTA: Ogni micropipetta sarà leggermente diversa. Per evitare di danneggiare la placenta durante l'iniezione, il tempo di iniezione deve essere impostato tra 0,5-1,5 s. La pressione deve essere impostata tra 1-8,5 psi. Calibrare ogni micropipetta separatamente; Se la micropipetta non può essere calibrata entro questi parametri, non deve essere utilizzata.
3. Chirurgia (Figura 1A)
NOTA: Per preparare, pulire le superfici sia delle aree di preparazione che chirurgiche con etanolo al 70%. Posizionare un sottopad assorbente nell'area di preparazione. Nell'area chirurgica, posizionare una piastra elettrica verso il basso, quindi posizionare un sottopad assorbente sopra di esso. Sterilizzare tutti gli strumenti prima dell'intervento chirurgico. Il tempo in cui la diga è sotto anestesia dovrebbe essere inferiore a 1 ora.
- Anestetizzazione
- Somministrare 5 mg/kg di FANS (meloxicam) o un altro analgesico approvato alla madre gravida da 30 minuti a 1 ora prima dell'intervento chirurgico.
- Posizionare la madre gravida in una camera di induzione collegata a un vaporizzatore di isoflurano.
- Impostare il vaporizzatore al 4% di isoflurano e 3,5 L/min di ossigeno.
- Una volta che l'anestetizzazione è stata confermata dalla mancanza di risposta a un pizzico del piede e da una frequenza respiratoria ridotta, rimuovere la diga dalla camera di induzione all'area di preparazione.
- Preparazione chirurgica
- Nell'area di preparazione, posizionare la diga supina con un cono nasale.
- Ridurre il vaporizzatore al 2% di isoflurano e 3,5 L/min di ossigeno mentre la diga è nel cono del naso.
- Rasare accuratamente l'addome della diga e rimuovere la pelliccia in eccesso. Alternare il rivestimento dell'addome rasato con soluzione di povidone e etanolo al 70% tre volte utilizzando applicatori sterili con punta di cotone. Applicare la mano finale di soluzione povidone. Per prevenire l'essiccazione corneale, posizionare un gel lacrimale artificiale su entrambi gli occhi della diga (Figura 2A, B).
- Dopo la preparazione, spostare la diga con il cono del naso nell'area chirurgica designata.
- Laparotomia uterina
NOTA: Utilizzare guanti sterili durante tutta la procedura chirurgica. Cambiare i guanti se viene contattata una superficie non sterile.- Nell'area chirurgica, posizionare la diga supina e fissare il cono del naso in posizione con del nastro adesivo. Impostare il termoforo sotto il tampone assorbente a 45 °C.
- Usando una pinza e le forbici, praticare un'incisione approssimativa della linea mediana di 2 cm attraverso la pelle. Utilizzare una pinza per tendere la pelle e fare un'incisione verticale nella pelle. Dopo questo, fai un'altra incisione di dimensioni simili attraverso il peritoneo per esporre le corna uterine. Usando una pinza, tenda il peritoneo mentre fai l'incisione verticale (Figura 2C, D).
NOTA: La mancata corretta tenda durante l'incisione del peritoneo può portare a un'incisione fatale dell'intestino. - Massaggiare delicatamente le corna uterine attraverso l'incisione premendo sui lati dell'addome. Fallo guidando attentamente l'utero senza attrezzi, usando solo le dita per evitare lesioni accidentali. Posizionare l'utero esposto sopra un drappo chirurgico sterile che copra l'addome della madre e mantenerlo umido durante l'intervento chirurgico con gocce di soluzione salina sterile, che può essere riscaldata a 30 °C prima dell'uso secondo necessità (Figura 2E, F).
NOTA: Le corna uterine possono essere identificate come descritto in Wang et al.27. - Una volta che l'utero è esposto, selezionare tre paia di placente per la manipolazione.
NOTA: Le placente possono essere identificate come descritto da Elmore et al.24. Per massimizzare la sopravvivenza degli embrioni, non devono essere trattate più di 6 placente. Se sono presenti meno di 12 embrioni, non devono essere iniettate più di 4 placente. Selezionare due placente adiacenti in modo che una riceva un'iniezione di controllo e l'altra riceva il plasmide sperimentale. L'uso di due placente adiacenti consente un migliore confronto delle placente in posizioni simili nell'utero e consente anche un aumento del tasso di sopravvivenza. Le coppie placentari selezionate sono scelte casualmente e distanziate su entrambe le corna uterine (Figura 1B). - Registrare la posizione delle manipolazioni placentari e l'organizzazione degli embrioni all'interno delle corna uterine in modo che gli embrioni e le placente possano essere identificati durante la raccolta, poiché una madre trasporterà sia placente di controllo che placente / embrioni trattati sperimentalmente.
- Iniezione placentare ed elettroporazione del plasmide di controllo
NOTA: Per mantenere una tecnica asettica, sterilizzare le palette di elettroporazione e il microiniettore con uno sterilizzante freddo prima dell'uso. Cambiare i guanti se viene contattata una superficie non sterile.- Utilizzando la micropipetta calibrata, caricare una quantità sufficiente del plasmide di controllo appropriato per tre iniezioni. Eseguire tutte le iniezioni ad una profondità di ~ 0,5 mm lateralmente nella placenta tra la decidua (bianco) e la zona giunzionale (rosso scuro) (Figura 3A-F).
- Eseguire iniezioni nelle tre placente di controllo.
NOTA: Eseguire tutte le iniezioni di plasmidi di controllo prima delle iniezioni sperimentali per evitare la contaminazione incrociata dei plasmidi con la micropipetta. Ciò consentirà di utilizzare la stessa micropipetta, poiché la sostituzione delle micropipette e il tempo di calibrazione aumentano drasticamente il tempo di intervento chirurgico e riducono la sopravvivenza della madre. - Eseguire l'elettroporazione delle placente iniettate con plasmide di controllo entro 2 minuti dall'iniezione.
- Per l'elettroporazione, utilizzare una coppia di pale da 3 mm collegate a una macchina per elettroporazione. Per garantire l'efficienza di incorporazione di CRISPR e la vitalità degli embrioni, utilizzare le seguenti impostazioni di elettroporazione: 2 impulsi, 30 V, impulso 30 ms, impulso off 970 ms, unipolare.
- Dopo l'iniezione ma immediatamente prima dell'elettroporazione, rivestire i punti di contatto con soluzione salina sterile, applicando la soluzione salina precisamente ai tre siti sulla parete uterina e le pale con un contagocce o una siringa.
- Premere delicatamente le palette di elettroporazione sui lati laterali della placenta. Posizionare la paletta dell'anodo sul sito di iniezione e sul catodo direttamente di fronte (Figura 4A-C).
- Premere l'impulso sulla macchina per elettroporazione e attendere il completamento dei due impulsi prima di rimuovere le palette di elettroporazione.
NOTA: Una piccola quantità di schiuma bianca è spesso vista tra le pagaie e la placenta durante gli impulsi. Se ciò non si verifica, controllare la tensione dalle pale con un voltmetro prima di un ulteriore utilizzo. Se la lettura sul voltmetro non corrisponde all'impostazione della tensione di elettroporazione, le palette non funzionano.
- Iniezione placentare ed elettroporazione del plasmide sperimentale
- Seguire le stesse istruzioni del punto 3.4.1. al punto 3.4.2. utilizzando il plasmide sperimentale invece del plasmide di controllo.
- Eseguire l'elettroporazione di tutte e tre le placente iniettate sperimentali entro 2 minuti dall'iniezione. Questo deve essere eseguito nello stesso modo di quelli iniettati con i plasmidi di controllo. Seguire il passaggio 3.4.4. al punto 3.4.7.
- Completamento dell'intervento chirurgico
- Una volta completata la manipolazione placentare, massaggiare delicatamente le corna uterine all'interno della cavità addominale usando solo le dita (Figura 5A).
- In primo luogo, eseguire suture singole a doppio nodo sullo strato di peritoneo utilizzando suture solubili rivestite e intrecciate lunghe 45 cm con una lega di aghi 3/8c da 13 mm. Distanziare le suture di 2-3 mm l'una dall'altra (Figura 5B).
- Dopo aver suturato lo strato di peritoneo, suturare la pelle con punti di sutura solubili. Triplo nodo le singole suture a 2-3 mm di distanza per garantire che la diga non possa annullare la sutura (Figura 5C).
- Una volta completata la sutura, impostare l'isoflurano all'1% e l'ossigeno a 3,5 L/min e applicare l'adesivo tissutale alle suture sulla pelle (Figura 5D).
NOTA: L'adesivo tissutale è facoltativo ma consigliato per evitare la riapertura dell'incisione a causa della masticazione della diga. - Quando l'adesivo si è asciugato, spegnere il vaporizzatore e rimuovere la diga dall'area chirurgica. Posiziona la diga in una gabbia di supporto sul dorso.
4. Assistenza e monitoraggio post-operatorio
- Lasciare che la madre gravida si riprenda in una gabbia pulita sotto supervisione per un minimo di 30 minuti per garantire che non ci siano complicazioni immediate dell'intervento. Osserva fino a quando non è completamente deambulante e può capovolgersi sui suoi piedi senza assistenza. Ospitare singolarmente la diga post-operatoria.
- Seguire le cure post-operatorie istituzionali e il monitoraggio fino al prelievo embrionale. Registrare il peso della diga e monitorare quotidianamente le suture e il sito di incisione.
5. E14.5 raccolta placentare
- Su E14.5, anestetizzare profondamente la diga con un cocktail ketamina / xilazina (1 mg / ml di ketamina e 0,1 mg / ml di xilazina), quindi dislocare cervicamente la diga.
- Fai un'incisione a forma di V nell'addome della diga con le forbici e rimuovi l'utero. Posizionare immediatamente su una capsula di Petri di 5 cm su ghiaccio. Usando una pinza, rimuovere con cura l'embrione e la placenta corrispondente dall'utero.
NOTA: Tenere un registro della posizione dell'embrione e della placenta corrispondente nelle corna uterine per determinare quale ha ricevuto la manipolazione diretta durante l'intervento chirurgico. - Registra i pesi placentari. Usando pinze e rasoi privi di RNAsi, tagliare la placenta a metà lungo la linea mediana. Mettere una metà in PFA al 4% a 4 °C. Tagliare nuovamente la metà rimanente a metà e conservare i restanti due quarti a -80 °C in due provette, una con reagente di stoccaggio dell'RNA.
NOTA: Gli embrioni e gli altri tessuti materni possono essere conservati dalla raccolta a -80 °C per un uso futuro.
6. Analisi dell'espressione genica placentare
- Utilizzare il quarto della placenta immagazzinato a -80 °C nel reagente di stoccaggio dell'RNA.
- Elaborare le placente per la qPCR come descritto in Elser et al. utilizzando il metodo Trizol per l'isolamento dell'RNA, uno spettrofotometro per la concentrazione di RNA, un kit di sintesi del cDNA e qPCR con SYBR Green Master Mix28. Al posto del kit Turbo DNAfree DNAse a cui si fa riferimento in Elser et al., utilizzare un kit RNAcleanup dopo l'isolamento dell'RNA Trizol per garantire che i campioni non contengano contaminanti28.
NOTA: leggere la scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) per Trizol e utilizzarla in una cappa aspirante chimica. - Valutare l'inserimento plasmidico del plasmide di controllo con primer GFP e del plasmide sperimentale con primer BLAST (primer elencati nella Tabella Supplementare 1). Utilizzare il valore CT per determinare la presenza del plasmide.
NOTA: i valori CT superiori a 35 sono falsi positivi e solo quelli inferiori a 35 devono essere considerati un indicatore positivo che il plasmide è stato inserito con successo. - Valutare l'espressione placentare di IGF-1 normalizzata al gene housekeeping 18s (primer elencati nella Tabella supplementare 1). Utilizzare il metodo ddCT per calcolare il cambiamento di piega e quindi calcolare il cambiamento di piega normalizzato dei campioni sperimentali al cambiamento medio di piega dei campioni di controllo.
7. Analisi del livello proteico placentare
- Utilizzare il quarto della placenta che è stato conservato a -80 °C. Omogeneizzare il tessuto in una soluzione tampone composta da 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl 2 e 10 mM di inibitore della proteasi in diH2O con un pH finale di 7,4. Utilizzare un omogeneizzatore portatile e un pestello per rompere il tessuto.
Nota : il campione non deve superare il 10% del volume del buffer. - Diluire i campioni omogeneizzati nel tampone a 1:12, in modo che rientrino nell'intervallo rilevabile di un kit di analisi dell'acido bicinconinico (BCA). Eseguire il test BCA secondo le istruzioni del produttore e quantificare la proteina totale utilizzando un lettore di piastre.
- Dopo aver eseguito il test BCA, normalizzare tutti i campioni alla stessa concentrazione proteica totale di 2 mg / ml per l'ELISA IGF-1, come fatto in Gumusoglu et al.29.
- Eseguire l'ELISA IGF-1 secondo le istruzioni del produttore e quantificare i livelli di proteina IGF-1 con un lettore di piastre utilizzando una curva di concentrazione standard.
8. Verifica CRIPSR spaziale mediante etichettatura ibridazione fluorescente in situ
- Dopo che le metà placentari sono state opportunamente fissate in PFA al 4% a 4 °C per 1-3 giorni, spostarle in saccarosio al 20% a 4 °C prima di congelarle nel composto a temperatura di taglio ottimale (OCT).
- Sezionare in serie le metà della placenta incorporata nell'OCT in un criostato a -20 °C in sezioni da 10 μm e posizionarle su vetrini da etichettare. Sezione la placenta si dimezza in modo che tutte e tre le sottoregioni siano visibili. Conservare i vetrini a -80 °C fino all'uso per l'ibridazione in situ .
- Eseguire l'etichettatura di ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) seguendo i protocolli del produttore. Ibridare un vetrino con una sonda dCas9-3xNLS-VP64 e un secondo vetrino "sorella" della stessa placenta con una sonda Prl8a8.
NOTA: La sonda dCas9-3xNLS-VP64 rileva la presenza del plasmide di sovraespressione. La sonda Prl8a8 evidenzia gli spongiotrofoblasti della zona giunzionale, che consente di identificare le sottoregioni della placenta. Queste due sonde sono etichettate su vetrini "fratelli" separati per evitare interferenze di fluorescenza multicanale con l'autofluorescenza verde nella placenta. - Etichettare entrambe le sonde con il colorante di rilevamento (Opal 620). Dopo aver completato il protocollo del produttore per FISH, applicare il supporto di montaggio DAPI e posizionare un coprivetrino sulla slitta. Sigillare la copertina con smalto trasparente.
- Immagina i vetrini su un microscopio a fluorescenza composto verticale ed elaborali utilizzando un software di elaborazione delle immagini appropriato. Qui è stato utilizzato il software CellSens.
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Representative Results
Risultati generali della procedura (Figura 6)
Nello studio, c'erano tre gruppi manipolati. Questi includevano placente iniettate con un plasmide di controllo generale CRISPR Cas9 (Cas9 Control), un plasmide CRISPR di controllo dell'attivazione (Act Control) o un plasmide di attivazione IGF-1 SAM (Igf1-OE). Il controllo Cas9 è più adatto per i plasmidi knockout e il controllo di attivazione è più adatto per i plasmidi di sovraespressione/attivazione. Per valutare i cambiamenti di vitalità causati dalla manipolazione della placenta tramite iniezione ed elettroporazione, la sopravvivenza dell'embrione all'interno della cucciolata è stata analizzata su E14.5 (Figura 6A). Questo punto temporale è stato selezionato in quanto altri studi che hanno eseguito l'inserimento in vivo di plasmidi CRISPR utilizzando l'elettroporazione hanno dimostrato che i cambiamenti di espressione possono essere raggiunti entro 8-22 h30,31,32. La raccolta a E14.5 consente al plasmide CRISPR di circa 48 ore di integrare e attivare un aumento dell'espressione genica. Si è scoperto che la manipolazione chirurgica della madre ha avuto un impatto sulla sopravvivenza di tutti gli embrioni, ma gli embrioni associati alle placente manipolate che sono state sottoposte a iniezione ed elettroporazione avevano significativamente ridotto la sopravvivenza. Il tasso di sopravvivenza degli embrioni non trattati (nella stessa cucciolata ma non sottoposti a manipolazione mirata) è diminuito dal 100% di sopravvivenza a una media del 79,05%. C'è stata una significativa diminuzione della sopravvivenza degli embrioni manipolati, con un tasso medio di sopravvivenza del 55,56%. Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa tra i tre gruppi manipolati.
Per determinare se si sono verificati cambiamenti grossolani significativi nelle placente manipolate, è stato registrato il peso placentare. Non c'era alcuna differenza significativa nel peso placentare di nessun gruppo (Figura 6B) e l'aspetto grossolano della placenta e dell'embrione era invariato. Le immagini rappresentative post-necroscopia sono state prese con un microscopio a dissezione al momento della raccolta su E14.5. Sono state scattate immagini delle placente / embrioni di diversi gruppi di trattamento, tutti all'interno della stessa cucciolata. Non ci sono stati danni evidenti o cambiamenti nell'aspetto fenotipico in nessun gruppo di trattamento né nel sacco amniotico né nell'embrione esposto e nella sua placenta corrispondente (Figura 6D-I). Mentre non sono state osservate differenze grossolane nella morfologia dei gruppi manipolati con l'uso di un plasmide di attivazione IGF-1, questo potrebbe non essere vero per altri plasmidi sperimentali mirati ad altri geni che possono avere un impatto più sostanziale sui regolatori essenziali della crescita e della funzione della placenta o dell'embrione. Non sono state riscontrate differenze in alcuna misura tra le placente Cas9 Control e Act Control. Pertanto, questi due gruppi sono stati combinati e indicati come Con o Controlli per tutte le analisi. Questi risultati dimostrano che la manipolazione delle placente in utero su E12.5 utilizzando questa tecnica provoca una diminuzione della sopravvivenza embrionale, ma c'è ancora una significativa vitalità. I risultati dimostrano anche che la crescita placentare non è nel complesso influenzata in modo significativo, in quanto non vi è stato alcun cambiamento significativo di peso tra le placente manipolate e non trattate. Ciò dimostra che la tecnica proposta può consentire la sopravvivenza di placente manipolate con CRISPR sane e vitali e dei loro embrioni corrispondenti.
La variazione del peso della madre è stata registrata ogni giorno dopo l'intervento chirurgico prima della raccolta degli embrioni su E14.5 (Figura 6C). L'intervento chirurgico ha avuto luogo su E12.5, quindi tutte le variazioni di peso della diga sono elencate rispetto al peso su E12.5. Le dighe sperimentali (Exp) sono state sottoposte a manipolazione placentare, mentre le dighe fittizie sono state sottoposte ad anestesia e laparotomia di durata simile senza manipolazione placentare. Molte madri gravide hanno mostrato una leggera diminuzione o nessuna variazione di peso il giorno dopo la procedura (E13.5); Ciò era probabilmente dovuto all'interruzione del consumo durante e brevemente dopo l'intervento chirurgico. La maggior parte delle dighe ha mostrato un aumento di peso su E14.5, ma occasionalmente è stata ancora osservata una diminuzione del peso. Il monitoraggio del peso della madre dopo l'intervento chirurgico ha permesso il monitoraggio della sopravvivenza dell'embrione. La variazione tra il peso delle madri gravide dopo l'intervento chirurgico era comune e non indicava che tutti gli embrioni trattati fossero persi. Non ci sono state differenze significative nei cambiamenti di peso post-chirurgici nelle dighe finte rispetto a quelle sperimentali. Ciò dimostra che il benessere della diga è stato generalmente preservato dopo l'inserimento dei plasmidi CRISPR nella placenta. Nel complesso, ciò dimostra che mentre questa tecnica chirurgica può causare una diminuzione della vitalità degli embrioni, produce ancora una percentuale significativa di progenie sana che può essere utilizzata per lo studio.
Analisi dell'espressione e dell'incorporazione di CRISPR nelle placente E14.5 (Figura 7)
Per determinare se l'inserimento cellulare del plasmide di attivazione dell'IGF-1 ha avuto successo per sovraesprimere IGF-1, è stata eseguita la qPCR. Come previsto, la qPCR ha mostrato un aumento significativo dell'espressione di IGF-1 nella placenta IGF1-OE rispetto alle placente di controllo quando il cambiamento di piega è stato normalizzato all'espressione di 18s (test t di Welch, p = 0,0302) (Figura 7A). Per determinare se i livelli della proteina IGF-1 erano alterati, è stato eseguito un ELISA sulla placenta di tutti i gruppi. Coerentemente con la qPCR, la valutazione ELISA delle placente E14.5 ha mostrato un aumento significativo dei livelli di proteina IGF-1 nelle placente IGF1-OE rispetto alle placente di controllo (test t di Welch, p = 0,0469) (Figura 7B). La qPCR e l'ELISA hanno dimostrato che il plasmide di sovraespressione ha aumentato con successo l'espressione genica di IGF-1 e la produzione di proteina IGF-1, rispettivamente.
Per garantire che la somministrazione del plasmide fosse specifica per le placente manipolate, è stata eseguita la qPCR per il plasmide di attivazione IGF-1 specifico e il plasmide CRISPR Cas9 Control. Queste qPCR sono state eseguite sia sulle placente manipolate che sulle placente non trattate adiacenti a quelle iniettate. I primer qPCR utilizzati per valutare l'espressione plasmidica di attivazione miravano a una sequenza del plasmide BLAST, che fa parte del sistema di attivazione (Figura 7C). Le placente non trattate non hanno mostrato alcuna presenza del plasmide BLAST (soglia del ciclo [CT] indeterminata, etichettata come 40 sul grafico), e la placenta Igf1-OE ha mostrato una TC intorno a 30. La qPCR eseguita per valutare l'espressione plasmidica di controllo mirava a una sequenza dal gene GFP inserito (Figura 7D). Le placente non trattate hanno mostrato valori di TC superiori a 35, probabilmente causati dalla dimerizzazione del primer, poiché questi valori sono al di fuori di un intervallo di espressione previsto. I controlli hanno mostrato un valore CT di circa 30. Queste qPCR servono come controllo di qualità per dimostrare la sovraespressione attesa di IGF-1 o la sua mancanza e che i plasmidi sono presenti solo nelle placente manipolate attese.
La verifica spaziale del plasmide di attivazione IGF-1 è stata eseguita utilizzando sezioni placentari. Le placente che sono state fissate e congelate nel composto OCT sono state sezionate in serie a 10 μm su vetrini in modo che tutti gli strati fossero visibili. I vetrini sono stati quindi congelati a -80 °C fino all'uso per l'etichettatura FISH. Per verificare dove all'interno della placenta è stato incorporato il plasmide di attivazione IGF-1 CRISPR, è stata utilizzata una sonda dCas9-3xNLS-VP64 con etichettatura fluorescente rossa. Questa sonda ha come destinazione un componente funzionale del sistema di attivazione. L'autofluorescenza verde è stata utilizzata per dimostrare le sottoregioni dell'interfaccia materno-fetale placentare (Figura 7E,F). Nessun dCas9-3xNLS-VP64 è stato rilevato nelle placente non trattate, poiché non erano state trattate con manipolazione CRISPR (Figura 7E). Come previsto, le placente IGF1-OE hanno visualizzato l'etichettatura per dCas9-3xNLS-VP64, come mostrato in rosso (Figura 7F). L'incorporazione di CRISPR è stata trovata in tutte e tre le sottoregioni della placenta, con l'etichettatura più chiara della zona giunzionale (Figura 7E). L'intensità di fluorescenza della marcatura dCas9-3xNLS-VP64 variava tra le placente trattate con plasmide, indicando che alcune esprimevano il plasmide più altamente di altre, e c'erano variazioni nella posizione precisa / estensione dell'etichettatura, ma l'etichettatura era generalmente presente in tutte le sottoregioni. Per confermare la posizione dell'etichettatura dCas9-3xNLS-VP64, è stata eseguita l'etichettatura Prl8a8 FISH mirata agli spongiotrofoblasti per etichettare la sottoregione giunzionale centrale (Figura 7G,H). Questo è stato eseguito in sezioni adiacenti dalla stessa placenta su un vetrino "sorella" delle sezioni etichettate per dCas9-3xNLS-VP64. Come previsto, la struttura indicata dall'etichettatura Prl8a8 era simile tra l'IGF1-OE e le placente non trattate. La decidua e la zona del labirinto potrebbero essere identificate dall'etichettatura dei nuclei blu (DAPI) che circondano la zona giunzionale rossa (Figura 7G,H). L'etichettatura FISH di dCas9-3xNLS-VP64 ha chiarito che il plasmide è stato inserito in tutte e tre le sottoregioni, e questo è stato confermato con l'etichettatura Prl8a8. I risultati dell'etichettatura FISH hanno confermato che l'incorporazione del plasmide di attivazione IGF-1 ha avuto successo e il plasmide non è migrato in placente non trattate.
Figura 1: Schema del protocollo . (A) Schema semplificato della procedura chirurgica. Ordine cronologico dei passaggi principali della tecnica. (B) Schema che mostra un esempio di spaziatura manipolata della placenta all'interno delle corna uterine. Entrambi i pannelli sono stati creati con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Procedura di laparotomia uterina. (A-B) Durante la preparazione chirurgica, (A) l'addome rasato di una diga e (B) l'area rasata rivestita con soluzione di iodio. (C-F) Nell'area chirurgica, (C) un'incisione di ~ 2 cm nella pelle addominale e (D) un'incisione di ~ 2 cm nel peritoneo; Gli intestini sono visibili. (E) Manipolare le corna uterine attraverso il sito di incisione. Le corna uterine sono visibili. (F) Corna uterine completamente esposte poste su un drappo chirurgico sterile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Iniezione di plasmidi CRISPR nella placenta E12.5. (A,B) Orientamento degli embrioni e della placenta all'interno delle corna uterine. (A) Vista obliqua di un corno uterino etichettato che mostra decidua, zone fetali e un embrione. La linea tratteggiata rappresenta dove dovrebbe essere il sito di iniezione. (B) Un corno uterino non etichettato dal pannello A. (C,D) Vista laterale della micropipetta inserita nel sito di iniezione nella placenta. D è la decidua, FZ è le zone fetali, E è l'embrione e la linea tratteggiata rappresenta la posizione del sito di iniezione. (D) Immagine non etichettata dell'inserimento della micropipetta dal pannello C. (E,F) Vista laterale del colorante nella placenta post-iniezione. (E) Immagine etichettata di un corno uterino che mostra una placenta che è stata iniettata con un plasmide CRIPSR contenente un colorante visibile e una placenta che non è stata iniettata. (F) Immagine non etichettata del corno uterino nel pannello E. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Elettroporazione della placenta E12.5 dopo l'iniezione di plasmidi CRISPR. (A) Vista dall'alto della placenta in un corno uterino. Le palette di elettroporazione dell'anodo e del catodo sono etichettate e la freccia bianca indica la posizione del sito di iniezione. (B) Vista obliqua dell'elettroporazione di una placenta. (C) Vista laterale dell'elettroporazione di una placenta. (D-F) Schema semplificato dei pannelli A, B e C. Le pale anodiche e catodiche sono etichettate, P è la placenta, E è l'embrione e l'area non etichettata è l'utero. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Sutura della pelle addominale e del peritoneo . (A) Le corna uterine sono tornate all'addome dopo il completamento dell'intervento chirurgico. Sono visibili incisioni della pelle addominale e del peritoneo. (B) Incisione del peritoneo completamente suturata. (C) Incisione cutanea addominale completamente suturata. (D) Applicazione di adesivo tissutale alle suture cutanee addominali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Risultati generali della procedura. (A) Tassi di sopravvivenza embrionale post-intervento raccolti su E14.5, 2 giorni dopo la procedura. Una significativa diminuzione della sopravvivenza è stata osservata nei gruppi manipolati rispetto agli embrioni non trattati (test U di Mann-Whitney: controllo non trattato vs. Cas9, p = 0,0077; Non trattato vs. Controllo dell'atto, p = 0,0330; e non trattato vs. IGF1-OE, p = 0,0032). Non sono state osservate differenze significative nella sopravvivenza dei gruppi manipolati (ANOVA unidirezionale, p = 0,9454). Ogni punto rappresenta la percentuale di sopravvivenza da una singola cucciolata (non trattata n = 22, Cas9 Control n = 9, Act Control n = 13 e IGF1-OE n = 22 cucciolate). (B) Peso placentare degli embrioni sopravvissuti su E14.5 (ANOVA unidirezionale, p = 0.1436) (n non trattato = 138, controllo Cas9 n = 15, controllo atto n = 20 e IGF1-OE n = 36 placente). (C) Variazioni di peso della diga post-intervento chirurgico su E13.5 ed E14.5 osservate in madri sottoposte a una procedura di laparotomia fittizia o sottoposte a manipolazione placentare sperimentale (Exp). Nessuna differenza significativa è stata osservata tra i cambiamenti di peso dei due gruppi di madri post-chirurgici (test t spaiati: E13,5 p = 0,5452 e E14,5 p = 0,2493) (dighe fittizie n = 3 e dighe Exp n = 10). Tutte le barre di errore rappresentano il SEM. (D-F) Immagini di embrioni E14.5 post-necroscopia nel sacco amniotico con la placenta ancora attaccata. (F) La barra della scala nell'angolo all'estrema destra rappresenta 3,75 mm. (G-I) Immagine obliqua dell'embrione e vista dall'alto della placenta corrispondente. (I) La barra della scala nell'angolo all'estrema destra rappresenta 3,75 mm. (D-I) Tutte le etichette dei gruppi di trattamento sono elencate sotto le immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Analisi dell'espressione e dell'incorporazione di CRISPR nelle placente E14.5. (A) Analisi qPCR dell'espressione di IGF-1 nel controllo E14.5 e nelle placente IGF1-OE. Un aumento significativo dell'espressione di IGF-1 normalizzata all'espressione di 18s è stato osservato nelle placente IGF1-OE (test t di Welch, p = 0,0302) (controllo n = 15 e IGF1-OE n = 20 placente). (B) ELISA dei livelli di proteina IGF-1 nel controllo E14.5 e nella placenta IGF1-OE. Un aumento significativo dei livelli di IGF-1 è stato osservato nelle placente IGF1-OE rispetto ai livelli di controllo (test t di Welch, p = 0,0469) (controllo n = 13 e IGF1-OE n = 15 placenta). (C) Analisi qPCR della sequenza BLAST dal plasmide IGF-1 SAM. L'espressione di BLAST è stata trovata solo nelle placente IGF1-OE e nessuna espressione / indeterminata è stata trovata nelle placente non trattate (n non trattate = 4 e IGF1-OE n = 9 placente). (D) analisi qPCR della sequenza GFP dal plasmide di controllo CRISPR Cas9. L'espressione del plasmide è stata trovata nelle placente di controllo e valori di TC superiori a 35 / risultati falsi positivi sono stati trovati nei campioni non trattati (n non trattati = 4 e controllo = 5 placente). La linea tratteggiata rappresenta la soglia dei falsi positivi a 35 CT. Ogni punto dati proviene da una placenta. Tutte le barre di errore rappresentano il SEM. (E-H) Ibridazione fluorescenza in situ di sezioni placentari E14.5 a 10 μm di spessore. (E) Sezioni placentari non trattate e (F) IGF1-OE con una sonda dCas9-3xNLS-VP64 marcata in rosso. Il segnale rosso è presente solo nella placenta IGF1-OE. Il segnale verde è l'autofluorescenza utilizzata per aiutare a identificare le sottoregioni placentari. (G) Sezioni di placenta non trattate e (H) IGF1-OE con una sonda Prl8a8 marcata in rosso per identificare gli spongiotrofoblasti della zona giunzionale media. DAPI in blu mostra le zone decidua e labirinto che circondano quella zona giunzionale. (H) La barra della scala nell'angolo all'estrema destra rappresenta 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella supplementare 1: Primer utilizzati in questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
La placenta è un regolatore primario della crescita fetale e, come notato in precedenza, i cambiamenti nell'espressione o nella funzione genica placentare possono avere un impatto significativo sullo sviluppo fetale6. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per eseguire una manipolazione CRISPR mirata in vivo della placenta del topo utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato. Questa tecnica consente una resa significativa di embrioni vitali e delle loro placente corrispondenti che possono essere utilizzate per ulteriori studi (Figura 6A, B). Questa tecnica ci ha permesso di sovraesprimere con successo l'IGF-1 placentare su E14.5 (Figura 7A,B). I plasmidi utilizzati hanno mostrato specificità, poiché i plasmidi inseriti sono rimasti nelle placente manipolate e non erano presenti nelle placente adiacenti non trattate (Figura 7C,D). La distribuzione spaziale del plasmide di attivazione IGF-1 è stata confermata da FISH per dCas9-3xNLS-VP64 e Prl8a8, che ha dimostrato che il plasmide di attivazione era presente nelle tre sottoregioni della placenta IGF1-OE e non in nessuna sottoregione delle placente non trattate (Figura 7E-H). Questa tecnica può essere utilizzata per alterare l'espressione genica placentare in modi che potrebbero non essere possibili con le tecniche precedenti. L'uso di questa tecnica consentirà una maggiore comprensione dell'influenza dell'espressione e della funzione genica placentare sullo sviluppo fetale in molteplici contesti.
Per ottimizzare il successo di questa procedura per gli esiti materni e fetali, sono stati esplorati gli effetti della modifica di più parametri, comprese le impostazioni di iniezione ed elettroporazione, nonché i materiali utilizzati. Per aumentare la sopravvivenza e il recupero della diga, è stato riscontrato che il tempo in anestesia non deve superare 1 ora, poiché periodi chirurgici più lunghi riducono significativamente la sopravvivenza. Se il tempo in anestesia raggiunge circa 2 ore, la probabilità di sopravvivenza è drasticamente ridotta a livelli inferiori al 20%, probabilmente a causa degli effetti negativi del tempo prolungato sotto isoflurano. Oltre al tempo sotto anestesia, la complicanza più comune della chirurgia che ha portato alla morte materna è stata l'incapacità di tendere correttamente il peritoneo durante le incisioni della pelle e del peritoneo. Se il peritoneo non è adeguatamente tenda, l'intestino può essere ferito, il che potrebbe causare la morte nei giorni post-chirurgici. Il tempo in cui l'utero è esposto influisce anche sulla sopravvivenza della madre e degli embrioni. Il tempo medio in cui l'utero è stato esposto in esperimenti di successo è stato di circa 15 minuti; Oltre 30 minuti di esposizione possono portare ad un aumento dei riassorbimenti e a possibili malattie materne. L'utero esposto e tutti gli altri organi esposti (spesso l'intestino) devono essere mantenuti umidi, ma troppa soluzione salina può raffreddare l'animale; quando si inumidiscono periodicamente gli organi esposti, deve essere usato meno di 1 ml di soluzione salina sterile.
I parametri dell'iniezione e dell'elettroporazione hanno avuto un grande impatto sulla sopravvivenza dell'embrione. Il volume di iniezione non deve superare circa 4,5 μL, poiché ciò ha comportato riassorbimenti. Il tempo e la pressione di iniezione sono importanti per massimizzare la sopravvivenza; Il tempo di iniezione deve essere impostato tra 0,5 s e 1,5 s, anche se 0,8 s sembrano ottimali. La pressione deve essere impostata tra 1-8,5 psi. Bassi tassi di sopravvivenza embrionale sono stati osservati con bassi tempi di iniezione e alti livelli di PSI per iniezione. È stato anche osservato che se la micropipetta era troppo smussata, potrebbe esserci una diminuzione della vitalità embrionale e la soluzione spesso fuoriesce dalla micropipetta. Il tipo di colorante utilizzato per visualizzare le iniezioni può influire sulla sopravvivenza. Il blu di metilene ha portato alla morte materna quando usato per questo scopo, ma una soluzione di colorante Fast Green filtrata non ha mostrato impatti negativi sulla salute materna. Le impostazioni di elettroporazione sono state ottimizzate rispetto alle impostazioni consigliate dal produttore sulla base di precedenti studi di elettroporazione in vivo33. L'elettroporazione è risultata essere la manipolazione che ha causato il maggior danno e ridotto la sopravvivenza dell'embrione. Le impostazioni raccomandate per l'elettroporazione degli embrioni in vivo suggeriscono quattro impulsi per massimizzare l'efficienza di CRISPR, ma due impulsi sono raccomandati per un tasso di sopravvivenza più elevato33. Si è scoperto che quattro impulsi hanno causato il riassorbimento di quasi tutti gli embrioni. Due impulsi hanno permesso una maggiore vitalità mantenendo l'efficienza CRISPR. Anche la dimensione della paletta per elettroporazione ha avuto un impatto significativo sulla sopravvivenza dell'embrione. È stato riscontrato che le palette per elettroporazione da 5 mm hanno portato a un riassorbimento quasi completo se utilizzate con le impostazioni consigliate. Infatti, le palette per elettroporazione da 3 mm sono raccomandate nella guida del produttore e aumentano significativamente la vitalità dell'embrione33. È anche importante notare che molte palette per elettroporazione hanno una certa durata del polso. Dopo che sono stati utilizzati a questo massimo, si può vedere una diminuzione della qualità. Questo può essere identificato se non c'è formazione di una piccola schiuma bianca tra le pagaie e la placenta durante un impulso. La tensione della paletta di elettroporazione può essere controllata utilizzando un voltmetro per determinare se sta producendo la tensione prevista.
Questo studio è limitato in alcuni modi. Questa tecnica è specifica del tempo e probabilmente viene eseguita al meglio non prima di E10.5 e non oltre E16.5. Ciò è dovuto al fatto che la placenta è troppo piccola prima di E10.5, e dopo E16.5, il plasmide potrebbe non avere abbastanza tempo per produrre l'effetto desiderato. Questo lasso di tempo significa che questa tecnica è più adatta per specifici tipi di studi sui topi. Questa tecnica è utile per studiare il neurosviluppo, poiché E12.5 rientra in un momento cruciale della neurogenesi per molte strutture all'interno del cervello34. Questa tecnica potrebbe non essere utile per studiare gli impatti placentari sulle prime fasi dello sviluppo, come la formazione della placca neurale, che avviene su E8.535. I risultati di un plasmide CRISPR knockout non sono noti in questo momento; L'applicazione di questo metodo alla riduzione dell'espressione genica richiede ulteriori indagini in quanto è stata dimostrata solo la sovraespressione/attivazione di un gene. Nonostante ciò, si prevede che questa tecnica avrebbe successo anche per l'inserimento di un plasmide CRISPR knockout.
Questa tecnica potrebbe anche consentire la possibilità di eseguire una coltura primaria di tessuto placentare geneticamente modificato36. A seconda del tipo di CRISPR utilizzato, come CRISPRi e CRISPRa, una coltura primaria potrebbe essere utilizzata per eseguire uno studio di salvataggio37,38. Questa tecnica potrebbe anche essere utilizzata per esplorare ulteriormente i legami tra anomalie genetiche e funzionali placentari e problemi nella prole. In particolare, uno studio precedente ha trovato una correlazione significativa tra punteggi di rischio genomico specifici della placenta e rischi di schizofrenia39. Questo studio ha identificato molti geni placentari che possono svolgere un ruolo nello sviluppo della schizofrenia che non sono stati esplorati nei modelli animali. Questa tecnica si presta ad ulteriori studi di questo tipo e altri.
Le conoscenze acquisite dalla modifica CRISPR della placenta potrebbero essere tradotte in una serie di diverse applicazioni biomediche. Gli studi che identificano come l'espressione genica specifica nella placenta può influire sullo sviluppo fetale potrebbero essere utilizzati per creare interventi farmacologici mirati alla placenta che potrebbero trattare queste anomalie. I trattamenti mirati direttamente a un feto possono essere difficili e pericolosi40,41. La placenta è un bersaglio più accessibile per il trattamento. Nel caso di problemi di sviluppo nel cuore o nel cervello che possono essere modificabili prenatale, la manipolazione diretta del cuore o del cervello è ad alto rischio. Tale rischio potrebbe essere evitato con l'intervento placentare, che è più plausibile e potrebbe portare a strategie preventive per i disturbi dello sviluppo neurologico per i quali l'ambiente molecolare, che è in parte fornito dalla placenta, può essere critico5. Questa tecnica potrebbe essere utilizzata anche per trattare malattie come la cardiopatia congenita, che è stata collegata a disturbi placentari9. Poiché la cardiopatia congenita è un difetto comune alla nascita, la possibilità di un trattamento di intervento placentare potrebbe avere un impatto significativo8. Poiché la placenta ha molte funzioni, questa tecnica potrebbe essere utilizzata per far progredire lo sviluppo di interventi per più malattie. Nel complesso, questa tecnica mirata alla placenta potrebbe essere utilizzata per approfondire la comprensione dell'influenza della genetica e della funzione placentare su più aree dello sviluppo fetale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono le seguenti fonti di finanziamento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 e NIH T32GM145441. Gli autori ringraziano i laboratori del Dr. Val Sheffield e del Dr. Calvin Carter presso l'Università dell'Iowa per l'uso della loro sala operatoria e delle attrezzature, così come il Dr. Eric Van Otterloo, il Dr. Nandakumar Narayanan, e il Dr. Matthew Weber per la loro assistenza con la microscopia. Gli autori ringraziano anche la dottoressa Sara Maurer, Maya Evans e Sreelekha Kundu per la loro assistenza con gli interventi chirurgici pilota.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 - 44 - 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/? |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24x60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
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