Summary
Her beskriver vi en tidsspesifikk metode for effektivt å manipulere kritiske utviklingsveier i musemorkaken in vivo. Dette utføres ved injeksjon og elektroporering av CRISPR-plasmider i morkakene til drektige dammer på embryonale dag 12.5.
Abstract
Morkaken er et viktig organ som regulerer og opprettholder pattedyrutvikling i livmoren. Morkaken er ansvarlig for overføring av næringsstoffer og avfall mellom mor og foster og produksjon og levering av vekstfaktorer og hormoner. Placenta genetiske manipulasjoner hos mus er avgjørende for å forstå morkakens spesifikke rolle i prenatal utvikling. Morkakespesifikke Cre-uttrykkende transgene mus har varierende effektivitet, og andre metoder for manipulering av placenta-gen kan være nyttige alternativer. Dette papiret beskriver en teknikk for direkte å endre placenta genuttrykk ved hjelp av CRISPR-genmanipulasjon, som kan brukes til å modifisere uttrykket av målrettede gener. Ved hjelp av en relativt avansert kirurgisk tilnærming gjennomgår gravide dammer en laparotomi på embryonal dag 12.5 (E12.5), og et CRISPR-plasmid leveres av en glassmikropipette inn i de enkelte placentaene. Plasmidet blir umiddelbart elektroporert etter hver injeksjon. Etter damutvinning kan morkakene og embryoene fortsette utviklingen til vurdering på et senere tidspunkt. Evalueringen av morkaken og avkom etter bruk av denne teknikken kan bestemme rollen som tidsspesifikk placentafunksjon i utviklingen. Denne typen manipulasjon vil gi en bedre forståelse av hvordan placenta genetikk og funksjon påvirker fosterets vekst og utvikling i flere sykdomskontekster.
Introduction
Morkaken er et viktig organ involvert i utviklingen av fosteret. Morkakens hovedrolle er å gi viktige faktorer og regulere overføringen av næringsstoffer og avfall til og fra fosteret. Pattedyrmorkaker består av både foster- og maternelt vev, som utgjør foster-mors grensesnitt, og dermed genetikken til både mor og fosterpåvirkningsfunksjon1. Genetiske anomalier eller nedsatt funksjon av morkaken kan drastisk endre fosterutvikling. Tidligere arbeid har vist at placenta genetikk og utvikling er forbundet med den endrede utviklingen av spesifikke organsystemer i fosteret. Spesielt er abnormiteter i morkaken knyttet til endringer i fosterets hjerne, hjerte og vaskulære system 2,3,4,5.
Transport av hormoner, vekstfaktorer og andre molekyler fra morkaken til fosteret spiller en viktig rolle i fosterets utvikling6. Det har vist seg at endring av placentaproduksjonen av spesifikke molekyler kan endre nevroutvikling. Mors betennelse kan øke produksjonen av serotonin ved å endre tryptofan (TRP) metabolsk genuttrykk i morkaken, som senere skaper en opphopning av serotonin i fosterets hjerne7. Andre studier har funnet placenta abnormiteter sammen med hjertefeil. Abnormaliteter i morkaken antas å bidra til medfødte hjertefeil, den vanligste fødselsdefekten hos mennesker8. En nylig studie har identifisert flere gener som har lignende cellulære veier i både morkaken og hjertet. Hvis de forstyrres, kan disse veiene forårsake defekter i begge organer9. Manglene i morkaken kan forverre medfødte hjertefeil. Rollen som placenta genetikk og funksjon på spesifikke fosterorgansystem utvikling er et fremvoksende fagområde.
Mus har hemokorial placentas og andre funksjoner i menneskelige placentas, noe som gjør dem svært nyttige modeller for å studere menneskelig sykdom1. Til tross for morkakens betydning, er det for tiden mangel på målrettede in vivo genetiske manipulasjoner. Videre er det for tiden flere alternativer tilgjengelig for knockouts eller knockdowns enn overexpression eller gain-of-function manipulasjoner i morkaken10. Det er flere transgene Cre-uttrykkende linjer for placental-spesifikk manipulasjon, hver i forskjellige trofoblastlinjer på forskjellige tidspunkter. Disse inkluderer Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER og Gcm1-Cre11,12,13,14. Selv om disse Cre-transgenene er effektive, kan de ikke være i stand til å manipulere noen gener på bestemte tidspunkter. En annen vanlig metode for å enten slå ut eller overuttrykke placenta-genuttrykk er innsetting av lentivirale vektorer i blastocystkultur, noe som forårsaker en trofoblastspesifikk genetisk manipulasjon15,16. Denne teknikken muliggjør en robust endring i placentagenuttrykket tidlig i utviklingen. Bruken av RNA-interferens in vivo har vært lite brukt i morkaken. Innsetting av shRNA-plasmider kan utføres på samme måte som CRIPSR-teknikken beskrevet i denne artikkelen. Dette har blitt gjort ved E13.5 for å lykkes med å redusere PlGF-uttrykk i morkaken, med innvirkning på avkoms hjernevaskulatur17.
I tillegg til teknikker som primært brukes til knockout eller knockdown, utføres induserende overekspresjon ofte med adenovirus eller innsetting av et eksogent protein. Teknikkene som brukes til overuttrykk har varierende grad av suksess og har for det meste blitt utført senere i svangerskapet. For å undersøke rollen til insulinlignende vekstfaktor 1 (IGF-1) i placentafunksjonen, ble det utført en adenoviralmediert placenta-genoverføring for å indusere overekspresjon av IGF-1-genet 18,19. Dette ble utført sent i musesvangerskapet på E18.5 via direkte placentainjeksjon. For å gi flere alternativer og omgå mulige feil i etablerte placentagenetiske manipulasjoner, for eksempel Cre-Lox-kombinasjonsfeil, mulig toksisitet av adenovirus og off-target effekter av shRNA, in vivo direkte CRISPR-manipulering av morkaken kan brukes20,21,22. Denne modellen ble utviklet for å adressere mangelen på overuttrykksmodeller og for å skape en modell med fleksibilitet.
Denne teknikken er basert på arbeidet til Lecuyer et al., der shRNA- og CRISPR-plasmider ble målrettet direkte in vivo til museplacentas for å endre PlGF-uttrykk 17. Denne teknikken kan brukes til å direkte endre placenta-genuttrykk ved hjelp av CRISPR-manipulering på flere tidspunkter; For dette arbeidet ble E12.5 valgt. Morkaken har modnet på dette tidspunktet og er stor nok til å manipulere, noe som gjør det mulig å sette inn et spesifikt CRISPR-plasmid på E12.5, som kan ha en betydelig innvirkning på fosterutviklingen fra midten til slutten av svangerskapet23,24. I motsetning til transgene tilnærminger, men ligner på virale induksjoner eller RNA-interferens, tillater denne teknikken overekspresjon eller knockout på bestemte tidspunkter ved hjelp av en relativt avansert kirurgisk tilnærming, og unngår dermed mulig nedsatt placentasjon eller embryonal dødelighet fra tidligere endringer. Siden bare noen få morkaker mottar eksperimentelt eller kontrollplasmid i et kull, tillater tilnærmingen to typer interne kontroller. Disse kontrollene er de som injiseres og elektroporeres med riktig kontrollplasmid og de som ikke mottar direkte manipulasjon. Denne teknikken ble optimalisert for å skape et overuttrykk av IGF-1-genet i musemorkaken via et synergistisk aktiveringsmediator (SAM) CRISPR-plasmid. Den IGF-1 genet ble valgt, som IGF-1 er et essensielt veksthormon levert til fosteret som primært produseres i morkaken før fødselen25,26. Denne nye placental-målrettede CRISPR-teknikken vil tillate direkte manipulering for å bidra til å definere sammenhengen mellom placentafunksjon og fosterutvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med og i samsvar med føderale forskrifter og University of Iowa-politikken og ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Dyr og dyrehold
- Hold dyrene i en 12 timers dagslyssyklus med mat og vann ad libitum.
- Bruk CD-1 hunnmus i alderen 8-15 uker. Bruk tilstedeværelsen av en kopulatorisk plugg for å identifisere E0.5.
- På E0.5 huser du de gravide dammene enkeltvis.
2. Kalibrering av mikropipetten
MERK: Kalibrering av mikropipetten bør utføres før kirurgi når det er mulig.
- Før mikropipetten lages og kalibreres, fortynnes alle plasmidene til anbefalt konsentrasjon (0,1 μg/μL) i DNase-fritt vann. Bland plasmidet med riktig fortynnet Fast Green-fargestoff (1 μg/μL i PBS) (endelig plasmidkonsentrasjon: 0,06 μg/μL).
- Trekk mikropipetter med 10 cm glasskapillærer med en ytre diameter på 1,5 mm og en indre diameter på 0,86 mm med en mikropipettetrekker.
- Brekk forsiktig av spissen av en mikropipette (2-3 mm) med steril tang.
- Legg mikropipetten i en mikrokapillærspiss festet til en mikroinjektor. Kontroller at mikroinjektoren er festet til mikroinjeksjonsmaskinen og at det er tilstrekkelige nivåer av nitrogen til å kalibrere mikropipetten.
- Når mikropipetten er festet til mikroinjektoren, fyller du den med Fast Green-fargestoffløsningen for å utføre kalibreringen (1 μg/μL i PBS). Kalibrer mikropipetten for å injisere et volum på ca. 3,5 μL. Tøm ("klar") mikropipetten som forberedelse til lasting av plasmidoppløsningene som nedenfor.
MERK: Hver mikropipette vil være litt forskjellig. For å unngå å skade morkaken under injeksjonen, bør injeksjonstiden settes mellom 0,5-1,5 s. Trykket skal settes mellom 1-8,5 psi. Kalibrer hver mikropipette separat; Hvis mikropipetten ikke kan kalibreres innenfor disse parametrene, bør den ikke brukes.
3. Kirurgi (figur 1A)
NOTAT: For å forberede, rengjør overflatene på både preparatet og kirurgiske områder med 70% etanol. Plasser en absorberende underpute i forberedelsesområdet. I operasjonsområdet, plasser en varmepute ned, og plasser deretter en absorberende underpad på toppen av denne. Steriliser alle verktøyene før operasjonen. Tiden dammen er under anestesi bør være under 1 time.
- Bedøvelse
- Administrer 5 mg / kg NSAID (meloksikam) eller et annet godkjent smertestillende middel til den gravide dammen 30 minutter til 1 time før operasjonen.
- Plasser den drektige dammen i et induksjonskammer festet til en isofluran fordamper.
- Sett fordamperen på 4 % isofluran og 3,5 l/min oksygen.
- Når bedøvelse er bekreftet av manglende respons på en tåklemme og redusert pustefrekvens, fjern dammen fra induksjonskammeret til forberedelsesområdet.
- Kirurgi forberedelse
- I forberedelsesområdet plasserer dammen liggende med en nesekegle.
- Reduser fordamperen til 2 % isofluran og 3,5 l/min oksygen mens demningen er i nesekjeglen.
- Barbere magen på dammen grundig og fjern overflødig pels. Alternativt belegg den barberte magen med povidonoppløsning og 70% etanol tre ganger ved hjelp av sterile bomullstippede applikatorer. Påfør endelig strøk povidonoppløsning. For å forhindre hornhinnetørking, plasser kunstig tåregel over begge øynene på dammen (figur 2A, B).
- Etter forberedelse, flytt dammen med nesekeglen til det angitte operasjonsområdet.
- Livmor laparotomi
MERK: Bruk sterile hansker under hele den kirurgiske prosedyren. Bytt hansker hvis en ikke-steril overflate er i kontakt.- I operasjonsområdet, plasser dammen liggende, og fest nesekjeglen på plass med tape. Sett varmeputen under den absorberende puten på 45 °C.
- Bruk tang og saks til å lage et omtrentlig 2 cm midtlinjesnitt gjennom huden. Bruk tang til å telte huden, og lag et vertikalt snitt i huden. Etter dette, gjør en annen tilsvarende størrelse snitt gjennom bukhinnen for å avsløre livmorhornene. Bruk tang til å telte bukhinnen mens du gjør det vertikale snittet (figur 2C, D).
MERK: Unnlatelse av å ordentlig telt mens snitt bukhinnen kan føre til et dødelig snitt av tarmene. - Masser forsiktig livmorhornene gjennom snittet ved å trykke på sidene av magen. Gjør dette ved å forsiktig lede livmoren uten verktøy, bruk bare fingrene for å unngå utilsiktet skade. Plasser den eksponerte livmoren på toppen av en steril kirurgisk drapering som dekker buken på dammen og hold den fuktig under hele operasjonen med dråper sterilt saltvann, som kan varmes opp til 30 °C før bruk etter behov (figur 2E, F).
MERK: Livmorhornene kan identifiseres som beskrevet i Wang et al.27. - Når livmoren er utsatt, velg tre par placentas for manipulering.
MERK: Morkaken kan identifiseres som beskrevet av Elmore et al.24. For å maksimere embryoens overlevelse, bør ikke mer enn 6 placentas behandles. Hvis det er færre enn 12 embryoer tilstede, skal ikke mer enn 4 morkaker injiseres. Velg to tilstøtende placentas slik at den ene mottar en kontrollinjeksjon og den andre mottar det eksperimentelle plasmidet. Bruken av to tilstøtende morkaker muliggjør en bedre sammenligning av morkaker på lignende steder i livmoren og muliggjør også økt overlevelse. De utvalgte placentaparene velges tilfeldig og fordeles mellom begge livmorhornene (figur 1B). - Registrer plasseringen av morkakemanipulasjoner og organisering av embryoene i livmorhornene slik at embryoene og morkakene kan identifiseres under innsamling, da en dam vil bære både kontroll- og eksperimentelt behandlede morkaker / embryoer.
- Placenta injeksjon og elektroporering av kontrollplasmidet
NOTAT: For å opprettholde en aseptisk teknikk, steriliser elektroporasjonspadlene og mikroinjektoren med et kaldt sterilt middel før bruk. Bytt hansker hvis en ikke-steril overflate er i kontakt.- Bruk den kalibrerte mikropipetten til å fylle en tilstrekkelig mengde av riktig kontrollplasmid til tre injeksjoner. Utfør alle injeksjonene på en dybde på ~0,5 mm lateralt inn i morkaken mellom decidua (hvit) og krysssonen (mørk rød) (figur 3A-F).
- Utfør injeksjoner i de tre kontrollplacentaene.
MERK: Utfør alle kontrollplasmidinjeksjoner før eksperimentelle injeksjoner for å unngå krysskontaminering av plasmidene med mikropipetten. Dette vil gjøre det mulig å bruke den samme mikropipetten, ettersom endring av mikropipetter og kalibreringstid drastisk øker operasjonstiden og reduserer damoverlevelsen. - Utfør elektroporering av kontrollplasmidinjiserte placentas innen 2 minutter etter injeksjonen.
- For elektroporering, bruk et par 3 mm padler festet til en elektroporasjonsmaskin. For å sikre CRISPR-inkorporeringseffektivitet og levedyktigheten til embryoer, bruk følgende elektroporeringsinnstillinger: 2 pulser, 30 V, 30 ms puls, 970 ms puls av, unipolar.
- Etter injeksjon, men umiddelbart før elektroporering, belegg kontaktstedene med steril saltvann, påfør saltvannet nøyaktig på de tre stedene på livmorveggen og padlene med en dråpe eller sprøyte.
- Trykk forsiktig på elektroporasjonspadlene på sidens sider av morkaken. Plasser anodepadlen over injeksjonsstedet og katoden rett overfor (figur 4A-C).
- Trykk på pulsen på elektroporasjonsmaskinen, og vent til de to pulsene er fullført før du fjerner elektroporasjonspadlene.
MERK: En liten mengde hvitt skum ses ofte mellom padlene og morkaken under pulser. Hvis dette ikke skjer, kontroller spenningen fra padlene med et voltmeter før videre bruk. Hvis avlesningen på voltmeteret ikke samsvarer med elektroporasjonsspenningsinnstillingen, er padlene ikke-funksjonelle.
- Placenta injeksjon og elektroporering av eksperimentelt plasmid
- Følg de samme instruksjonene fra trinn 3.4.1. til trinn 3.4.2. ved å bruke det eksperimentelle plasmidet i stedet for kontrollplasmidet.
- Utfør elektroporering av alle tre eksperimentelle injiserte placentas innen 2 minutter etter injeksjonen. Dette bør utføres på samme måte som for de som injiseres med kontrollplasmidene. Følg trinn 3.4.4. til trinn 3.4.7.
- Gjennomføring av operasjonen
- Når morkakemanipulasjonen er fullført, masserer du forsiktig livmorhornene tilbake i bukhulen med bare fingrene (figur 5A).
- Utfør først dobbeltknyttede enkeltsuturer på bukhinnelaget ved bruk av belagte og flettede oppløselige suturer som er 45 cm lange med en 13 mm 3/8c nålelegering. Plasser suturene 2-3 mm fra hverandre (figur 5B).
- Etter suturering av bukhinnen, sutur huden med oppløselige suturer. Trippelknute enkeltsuturene 2-3 mm fra hverandre for å sikre at demningen ikke kan angre sutureringen (figur 5C).
- Når sutureringen er fullført, sett isofluran på 1 % og oksygenet på 3,5 l/min, og påfør vevslim på suturene på huden (figur 5D).
MERK: Vevlim er valgfritt, men anbefales for å forhindre gjenåpning av snittet på grunn av damtygging. - Når vevlimet har tørket, slå av fordamperen og fjern dammen fra operasjonsområdet. Plasser demningen i et støttende bur på ryggen.
4. Pleie og overvåking etter operasjonen
- La den gravide dammen komme seg i et rent bur under tilsyn i minst 30 minutter for å sikre ingen umiddelbare komplikasjoner av operasjonen. Observer til den er helt ambulerende og kan snu på føttene uten hjelp. Huser demningen etter operasjonen.
- Følg institusjonell postoperativ behandling og overvåking til embryoinnsamling. Registrer damvekten, og overvåk suturene og snittstedet daglig.
5. E14.5 Oppsamling av morkake
- På E14.5, dypt bedøve dammen med en ketamin / xylazin cocktail (1 mg / ml ketamin og 0,1 mg / ml xylazin), og deretter cervically forskyve dammen.
- Lag et V-formet snitt i dammens buk med saks, og fjern livmoren. Legg umiddelbart på en 5 cm petriskål på is. Bruk tang, fjern forsiktig embryoet og den tilsvarende morkaken fra livmoren.
MERK: Hold oversikt over embryoets plassering og tilsvarende morkake i livmorhornene for å bestemme hvilken som mottok direkte manipulasjon under operasjonen. - Registrer placentavektene. Bruk RNAse-fri tang og barberhøvler, kutt morkaken i to nedover midtlinjen. Sett halvparten i 4% PFA ved 4 ° C. Skjær den resterende halvdelen i to igjen, og oppbevar de resterende to kvartalene ved -80 °C i to rør, ett med RNA-lagringsreagens.
MERK: Embryoer og annet maternalt vev kan lagres fra samlingen ved -80 ° C for fremtidig bruk.
6. Placental genuttrykksanalyse
- Bruk fjerdedelen av morkaken som er lagret ved -80 °C i RNA-lagringsreagens.
- Behandle morkakene for qPCR som beskrevet i Elser et al. ved hjelp av Trizol-metoden for RNA-isolasjon, et spektrofotometer for RNA-konsentrasjon, et cDNA-syntesesett og qPCR med SYBR Green Master Mix28. I stedet for Turbo DNAfree-settet DNAse referert til i Elser et al., bruk et RNAcleanup-sett etter Trizol RNA-isolasjonen for å sikre at prøvene ikke inneholder forurensninger28.
MERK: Les sikkerhetsdatabladet (MSDS) for Trizol, og bruk det i en kjemisk avtrekkshette. - Vurder plasmidinnsettingen av kontrollplasmidet med GFP-primere og av det eksperimentelle plasmidet med BLAST-primere (primere oppført i tilleggstabell 1). Bruk CT-verdien for å bestemme tilstedeværelsen av plasmidet.
MERK: CT-verdier over 35 er falske positive, og bare de under 35 bør betraktes som en positiv indikator på at plasmidet ble vellykket satt inn. - Vurder IGF-1 placenta uttrykk normalisert til housekeeping genet 18s (primere oppført i tilleggstabell 1). Bruk ddCT-metoden til å beregne foldeendringen, og beregn deretter den normaliserte foldeendringen av eksperimentelle prøver til gjennomsnittlig foldendring av kontrollprøvene.
7. Analyse av placentaproteinnivå
- Bruk den fjerdedelen av morkaken som er oppbevart ved −80 °C. Homogeniser vevet i en bufferløsning laget av 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl 2 og 10 mM proteasehemmer i diH2 O med en endelig pH på 7,4. Bruk en håndholdt homogenisator og pistill for å bryte opp vevet.
MERK: Prøven skal ikke overstige 10 % av buffervolumet. - Fortynn de homogeniserte prøvene i bufferen ved 1:12, slik at de er innenfor det detekterbare området for et bicinchoninsyreanalysesett (BCA). Utfør BCA-analysen i henhold til produsentens instruksjoner, og kvantifiser det totale proteinet ved hjelp av en plateleser.
- Etter å ha utført BCA-analysen, normaliser alle prøvene til samme totale proteinkonsentrasjon på 2 mg / ml for IGF-1 ELISA, som gjort i Gumusoglu et al.29.
- Utfør IGF-1 ELISA i henhold til produsentens instruksjoner, og kvantifisere IGF-1 protein nivåer med en plateleser ved hjelp av en standard konsentrasjonskurve.
8. Romlig CRIPSR-verifisering ved bruk av fluorescerende in situ hybridiseringsmerking
- Etter at placentahalvdelene er riktig festet i 4 % PFA ved 4 °C i 1-3 dager, flytt dem til 20 % sukrose ved 4 °C før de fryses i optimal skjæretemperatur (OCT).
- Serieseksjon de okt-innebygde placentahalvdelene i en -20 °C kryostat i 10 μm seksjoner, og plasser dem på lysbilder som skal merkes. Seksjoner morkakehalvdelene slik at alle tre underregionene er synlige. Oppbevar lysbildene ved -80 °C til bruk for in situ hybridisering.
- Utfør fluorescens in situ hybridisering (FISH) merking i henhold til produsentens protokoller. Hybridiser ett lysbilde med en dCas9-3xNLS-VP64-sonde og et andre "søsterlysbilde" av samme morkake med en Prl8a8-sonde.
MERK: dCas9-3xNLS-VP64-sonden oppdager tilstedeværelsen av overuttrykksplasmidet. Prl8a8-sonden fremhever spongiotrofoblaster i krysssonen, noe som gjør det mulig for underregionene i morkaken å være identifiserbare. Disse to sondene er merket på separate "søster" -lysbilder for å unngå forstyrrelser av flerkanals fluorescens med den grønne autofluorescensen i morkakene. - Merk begge sondene med deteksjonsfargen (Opal 620). Etter å ha fullført produsentens protokoll for FISH, bruk DAPI-monteringsmedium og legg en dekselslip på lysbildet. Forsegl dekselet med klar neglelakk.
- Bilde lysbildene på en oppreist sammensatt fluorescens mikroskop, og behandle dem ved hjelp av en passende bildebehandling programvare. Her ble CellSens-programvaren brukt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generelle prosedyreresultater (figur 6)
I studien var det tre manipulerte grupper. Disse inkluderte placentas injisert med et generelt CRISPR Cas9-kontrollplasmid (Cas9 Control), et aktiveringskontroll CRISPR-plasmid (Act Control) eller et IGF-1 SAM-aktiveringsplasmid (Igf1-OE). Cas9 Control er bedre egnet for knockout-plasmider, og aktiveringskontrollen er bedre egnet for overekspresjons-/aktiveringsplasmider. For å vurdere levedyktighetsendringene forårsaket av manipulering av morkakene via injeksjon og elektroporering, ble embryooverlevelse i kullet analysert på E14.5 (figur 6A). Dette tidspunktet ble valgt da andre studier som har utført in vivo-innsetting av CRISPR-plasmider ved bruk av elektroporering har vist at ekspresjonsendringer kan oppnås innen 8-22 timer30,31,32. Innsamling ved E14.5 tillater CRISPR-plasmidet ca. 48 timer å integrere og aktivere en økning i genuttrykk. Det ble funnet at kirurgisk manipulering av dammen påvirket overlevelsen til alle embryoene, men embryoene assosiert med de manipulerte morkakene som gjennomgikk injeksjon og elektroporering hadde signifikant redusert overlevelse. Overlevelsesraten til de ubehandlede embryoene (i samme kull, men ikke under målrettet manipulasjon) ble redusert fra 100% overlevelse til et gjennomsnitt på 79,05%. Det var en signifikant reduksjon i overlevelsen til de manipulerte embryoene, med en gjennomsnittlig overlevelsesrate på 55,56%. Det ble ikke funnet noen signifikant forskjell mellom de tre manipulerte gruppene.
For å avgjøre om det skjedde signifikante grove endringer i de manipulerte morkakene, ble placentavekten registrert. Det var ingen signifikant forskjell i noen gruppes placentavekt (figur 6B), og morkakens og embryoets bruttoutseende var uendret. Representative postnekroskopibilder ble tatt på disseksjonsmikroskop ved innsamling på E14.5. Det ble tatt bilder av morkakene/embryoene fra ulike behandlingsgrupper, alle innenfor samme kull. Det var ingen merkbar skade eller endring i fenotypisk utseende i noen behandlingsgrupper, verken i fostervesken eller det eksponerte embryoet og dets korresponderende placenta (figur 6D-I). Selv om det ikke ble sett noen grove forskjeller i morfologien til de manipulerte gruppene ved bruk av et IGF-1-aktiveringsplasmid, kan dette ikke være sant for andre eksperimentelle plasmider rettet mot andre gener som mer vesentlig kan påvirke essensielle vekst- og funksjonsregulatorer av morkaken eller embryoet. Det ble ikke funnet forskjeller i noe mål mellom Cas9 Control og Act Control placentaene. Derfor ble disse to gruppene kombinert og referert til som Con eller Controls for alle analysene. Disse resultatene viser at manipulering av morkaker in utero på E12.5 ved hjelp av denne teknikken forårsaker en reduksjon i embryooverlevelse, men det er fortsatt betydelig levedyktighet. Resultatene viser også at placentaveksten generelt ikke er signifikant påvirket, da det ikke var noen signifikant endring i vekt mellom de manipulerte og ubehandlede morkakene. Dette viser at den foreslåtte teknikken kan tillate overlevelse av sunne og levedyktige CRISPR-manipulerte morkaker og deres tilsvarende embryoer.
Damvektendring ble registrert hver dag etter operasjonen før embryoinnsamling på E14.5 (figur 6C). Operasjonen fant sted på E12.5, så alle damvektendringene er oppført i forhold til vekten på E12.5. De eksperimentelle (Exp) dammene gjennomgikk placentamanipulasjon, mens humbugdammer gjennomgikk anestesi og laparotomi av tilsvarende varighet uten morkakemanipulasjon. Mange drektige dammer viste en liten eller ingen endring i vekt dagen etter inngrepet (E13.5); Dette skyldtes sannsynligvis forstyrret spising under og kort tid etter operasjonen. De fleste dammene viste vektøkning på E14,5, men det ble likevel av og til observert en nedgang i vekt. Sporing av mors damvekt etter operasjonen tillot overvåking av embryooverlevelse. Variasjon mellom de gravide dammenes vekt etter operasjonen var vanlig og indikerte ikke at alle de behandlede embryoene gikk tapt. Det var ingen signifikante forskjeller i vektendringer etter operasjonen i humbug versus eksperimentelle dammer. Dette viser at dammens velvære generelt ble bevart etter at CRISPR-plasmidene ble satt inn i morkaken. Samlet sett viser dette at mens denne kirurgiske teknikken kan føre til en reduksjon i levedyktigheten til embryoer, gir den fortsatt en betydelig prosentandel av sunt avkom som kan brukes til studien.
Analyse av ekspresjon og CRISPR-inkorporering i E14.5 placentas (figur 7)
For å avgjøre om den cellulære innsettingen av IGF-1-aktiveringsplasmidet var vellykket for overuttrykking av IGF-1, ble qPCR utført. Som forventet viste qPCR en signifikant økning i IGF-1-uttrykk i IGF1-OE-placentas versus kontrollplacentas når foldeendringen ble normalisert til 18s uttrykk (Welchs t-test, p = 0,0302) (figur 7A). For å avgjøre om IGF-1-proteinnivåene ble endret, ble det utført en ELISA på morkakene fra alle gruppene. I samsvar med qPCR viste ELISA-vurderingen av E14.5-placentas en signifikant økning i IGF-1-proteinnivåer i IGF1-OE-placentas versus kontrollplacentas (Welchs t-test, p = 0.0469) (figur 7B). qPCR og ELISA viste at overekspresjonsplasmidet vellykket økte henholdsvis IGF-1-genuttrykk og IGF-1-proteinproduksjon.
For å sikre at leveransen av plasmidet var spesifikt for de manipulerte placentaene, ble det utført qPCR for det spesifikke IGF-1-aktiveringsplasmidet og CRISPR Cas9 Control-plasmidet. Disse qPCR ble utført på både de manipulerte placentas og de ubehandlede placentas som var tilstøtende til de injiserte. qPCR-primerne som ble brukt til å vurdere aktiveringsplasmiduttrykket, var rettet mot en sekvens av BLAST-plasmidet, som er en del av aktiveringssystemet (figur 7C). De ubehandlede placentas viste ingen tilstedeværelse av BLAST-plasmidet (syklusterskel [CT] ubestemt, merket som 40 på grafen), og Igf1-OE-placentas viste CT rundt 30. qPCR utført for å vurdere kontrollplasmidekspresjonen rettet seg mot en sekvens fra det innsatte GFP-genet (figur 7D). De ubehandlede morkakene viste CT-verdier over 35, sannsynligvis forårsaket av primerdimerisering, da disse verdiene er utenfor et forventet uttrykksområde. Kontrollene viste en CT-verdi på ca. 30. Disse qPCRene tjener som en kvalitetskontroll for å demonstrere forventet overekspresjon av IGF-1 eller mangel på sådan, og at plasmidene bare er tilstede i de forventede manipulerte morkakene.
Romlig verifisering av IGF-1 aktiveringsplasmid ble utført ved bruk av placentasnitt. Morkaker som var festet og frosset i OCT-forbindelse ble seriesnittet ved 10 μm på lysbilder slik at alle lagene var synlige. Skliene ble deretter frosset ved −80 °C til bruk for FISH-merking. For å verifisere hvor i morkaken IGF-1 CRISPR-aktiveringsplasmidet ble innlemmet, ble en dCas9-3xNLS-VP64-sonde med rød fluorescerende merking brukt. Denne sonden retter seg mot en funksjonell komponent i aktiveringssystemet. Grønn autofluorescens ble brukt for å demonstrere subregionene i placenta-grensesnittet mellom mor og foster (figur 7E,F). Det ble ikke påvist dCas9-3xNLS-VP64 i de ubehandlede placentaene, da de ikke var behandlet med CRISPR-manipulasjon (figur 7E). Som forventet viste IGF1-OE-placentaene merking for dCas9-3xNLS-VP64, som vist i rødt (figur 7F). CRISPR-inkorporering ble funnet i alle tre underregioner av morkaken, med den klareste merkingen av krysssonen (figur 7E). Fluorescensintensiteten til dCas9-3xNLS-VP64-merkingen varierte på tvers av plasmidbehandlede placentaer, noe som indikerte at noen uttrykte plasmidet høyere enn andre, og det var variasjoner i den nøyaktige plasseringen / omfanget av merkingen, men merking var generelt tilstede i alle underregionene. For å bekrefte plasseringen av dCas9-3xNLS-VP64-merkingen ble Prl8a8 FISH-merking rettet mot spongiotrofoblaster utført for å merke den midtre kryssunderregionen (figur 7G,H). Dette ble utført i tilstøtende seksjoner fra samme placenta på et "søster" lysbilde av seksjonene som var merket for dCas9-3xNLS-VP64. Som forventet var strukturen indikert av Prl8a8-merking lik mellom IGF1-OE og ubehandlede morkaker. Decidua og labyrintsonen kunne identifiseres ved de blå kjernene (DAPI) merking rundt den røde krysssonen (figur 7G,H). FISH-merkingen av dCas9-3xNLS-VP64 tydeliggjorde at plasmidet ble satt inn i alle tre underregioner, og dette ble bekreftet med Prl8a8-merking. Resultatene av FISH-merkingen bekreftet at innlemmelsen av IGF-1-aktiveringsplasmidet var vellykket, og plasmidet migrerte ikke til ubehandlede placenta.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av protokollen . (A) Forenklet skjematisk fremstilling av den kirurgiske prosedyren. Kronologisk rekkefølge av de viktigste trinnene i teknikken. (B) Skjematisk viser et eksempel på manipulert placentaavstand i livmorhornene. Begge panelene ble laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Uterus laparotomi prosedyre. (A-B) Under forberedelsen av operasjonen, (A) den barberte buken til en dam, og (B) det barberte området belagt med jodoppløsning. (VG Nett) I operasjonsområdet, (C) et ~ 2 cm snitt i bukhuden, og (D) et ~ 2 cm snitt i bukhinnen; tarmene er synlige. (E) Manipulere livmorhornene gjennom snittstedet. Livmorhorn er synlige. (F) Fullstendig eksponerte livmorhorn plassert på en steril kirurgisk drapering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Injeksjon av CRISPR-plasmider i E12.5 placentas. (A,B) Orientering av embryoer og placenta i livmorhornene. (A) Skrå visning av et merket livmorhorn som viser løvfeller, fostersoner og et embryo. Den stiplede streken representerer hvor injeksjonsstedet skal være. (B) Et umerket livmorhorn fra panel A. (C,D) Sett fra siden av mikropipetten som er satt inn på injeksjonsstedet i morkaken. D er decidua, FZ er fostersonene, E er embryoet, og den stiplede linjen representerer injeksjonsstedet. (D) Umerket bilde av mikropipettinnsettingen fra panel C. (E,F) Sidevisning av fargestoff i morkaken etter injeksjon. (E) Merket bilde av et livmorhorn som viser en placenta som har blitt injisert med et CRIPSR-plasmid som inneholder et synlig fargestoff og en placenta som ikke er injisert. (F) Umerket bilde av livmorhornet i panel E. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Elektroporering av E12.5 placentas etter injeksjon av CRISPR-plasmider. (A) Toppvisning av morkaker i et livmorhorn. Anode- og katodeelektroporasjonspadlene er merket, og den hvite pilen indikerer plasseringen av injeksjonsstedet. (B) Skrå visning av elektroporering av en morkake. (C) Sidevisning av elektroporering av en morkake. (VG Nett) Forenklet disposisjon av panelene A, B og C. Anoden og katodepadlene er merket, P er morkaken, E er embryoet, og det umerkede området er livmoren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Suturering av abdominal hud og bukhinne. (A) Livmorhorn returnerte til magen etter at operasjonen var fullført. Abdominale hud- og bukhinnesnitt er synlige. (B) Peritoneum snitt fullstendig suturert. (C) Abdominal hud snitt fullstendig suturert. (D) Påføring av vevslim på suturene i bukhuden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Generelle prosedyreutfall. (A) Embryooverlevelse etter kirurgi samlet på E14.5, 2 dager etter prosedyren. En signifikant reduksjon i overlevelse ble observert i de manipulerte gruppene versus de ubehandlede embryoene (Mann-Whitney U-test: Ubehandlet vs. Cas9 Control, p = 0,0077; Ubehandlet vs. handlingskontroll, p = 0,0330; og Ubehandlet vs. IGF1-OE, p = 0,0032). Det ble ikke observert signifikante forskjeller i overlevelsen til de manipulerte gruppene (enveis ANOVA, p = 0,9454). Hvert punkt representerer overlevelsesprosenten fra et enkelt kull (Ubehandlet n = 22, Cas9 Control n = 9, Act Control n = 13 og IGF1-OE n = 22 kull). (B) Morkakevekten til de overlevende embryoene på E14,5 (enveis ANOVA, p = 0,1436) (Ubehandlet n = 138, Cas9 Control n = 15, Act Control n = 20 og IGF1-OE n = 36 placentas). (C) Damvektendringer etter operasjon på E13.5 og E14.5 sett i dammer som gjennomgikk en falsk laparotomiprosedyre eller gjennomgikk eksperimentell (Exp) placentamanipulasjon. Det ses ingen signifikant forskjell mellom de to gruppene av dammers vektendringer etter kirurgi (Uparede t-tester: E13,5 p = 0,5452 og E14,5 p = 0,2493) (Sham dammer n = 3 og Exp dammer n = 10). Alle feilfeltene representerer SEM. (D-F) Bilder av E14.5-embryoer etter nekroskopi i fostervesken med morkaken fortsatt festet. (F) Skalastangen helt til høyre representerer 3,75 mm. (G-I) Skrå bilde av embryoet og toppbilde av den tilsvarende morkaken. (I) Skalastangen helt til høyre representerer 3,75 mm. (D-I) Alle etikettene til behandlingsgruppen er oppført under bildene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Analyse av uttrykk og CRISPR-inkorporering i E14.5 placentas. (A) qPCR-analyse av IGF-1-uttrykk i E14.5-kontroll og IGF1-OE-placenta. En signifikant økning i IGF-1-uttrykk normalisert til 18s uttrykk ble observert i IGF1-OE placentas (Welchs t-test, p = 0,0302) (kontroll n = 15 og IGF1-OE n = 20 placentas). (B) ELISA av IGF-1 protein nivåer i E14.5 kontroll og IGF1-OE placentas. En signifikant økning i IGF-1 nivåer ble observert i IGF1-OE placentas sammenlignet med kontrollnivåer (Welchs t-test, p = 0,0469) (kontroll n = 13 og IGF1-OE n = 15 placentas.) (C) qPCR-analyse av BLAST-sekvens fra IGF-1 SAM-plasmid. Uttrykket av BLAST ble kun funnet i IGF1-OE placentaene, og det ble funnet ingen/ubestemt uttrykk i de ubehandlede placentaene (Ubehandlet n = 4 og IGF1-OE n = 9 placentaer). (D) qPCR-analyse av GFP-sekvensen fra CRISPR Cas9-kontrollplasmidet. Det ble funnet ekspresjon av plasmidet i kontrollplacenta, og det ble funnet CT-verdier over 35/falskt positivt resultat i de ubehandlede prøvene (Ubehandlet n = 4 og Control = 5 placenta). Den stiplede linjen representerer den falskt positive terskelen ved 35 CT. Hvert datapunkt er fra én morkake. Alle feilfelt representerer SEM. (E-H) Fluorescens in situ hybridisering av E14.5 placentaseksjoner ved 10 μm tykkelse. (E) Ubehandlede og (F) IGF1-OE placenta seksjoner med en dCas9-3xNLS-VP64 sonde merket i rødt. Det røde signalet er bare til stede i IGF1-OE placenta. Det grønne signalet er autofluorescens som brukes til å identifisere placenta-underregionene. (G) Ubehandlede og (H) IGF1-OE placentaseksjoner med en Prl8a8-sonde merket med rødt for å identifisere spongiotrofoblaster i den midtre krysssonen. DAPI i blått viser decidua- og labyrintsonene som omgir den krysssonen. (H) Skalastangen helt til høyre representerer 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell 1: Primere brukt i denne studien. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Morkaken er en primær regulator av fostervekst, og som tidligere nevnt kan endringer i morkakens genuttrykk eller funksjon påvirkefosterutviklingen betydelig. Protokollen som er skissert her kan brukes til å utføre en målrettet in vivo CRISPR-manipulering av musemorkaken ved hjelp av en relativt avansert kirurgisk tilnærming. Denne teknikken muliggjør et betydelig utbytte av levedyktige embryoer og deres tilsvarende placentas som kan brukes til videre studier (figur 6A, B). Denne teknikken tillot oss å overuttrykke placenta IGF-1 på E14.5 (figur 7A, B). Plasmidene som ble brukt, viste spesifisitet, da de innsatte plasmidene forble i de manipulerte placentas og ikke var tilstede i de tilstøtende ubehandlede placentas (figur 7C,D). Den romlige fordelingen av IGF-1-aktiveringsplasmidet ble bekreftet av FISH for dCas9-3xNLS-VP64 og Prl8a8, som viste at aktiveringsplasmidet var tilstede i de tre underregionene av IGF1-OE-placentas og ikke i noen underregioner av de ubehandlede placentas (figur 7E-H). Denne teknikken kan brukes til å endre placenta genuttrykk på måter som kanskje ikke er mulig med tidligere teknikker. Bruken av denne teknikken vil muliggjøre en større forståelse av påvirkning av placenta genuttrykk og funksjon på fosterutvikling i flere sammenhenger.
For å optimalisere suksessen til denne prosedyren for maternelle og fosterutfall, ble effekten av å endre flere parametere utforsket, inkludert injeksjons- og elektroporasjonsinnstillingene, samt materialene som ble brukt. For å øke dammens overlevelse og gjenoppretting ble det funnet at tiden under anestesi ikke skulle overstige 1 time, da lengre operasjonsperioder reduserte overlevelsen betydelig. Hvis tiden under anestesi når ca. 2 timer, reduseres sannsynligheten for overlevelse dramatisk til nivåer under 20%, sannsynligvis på grunn av de negative effektene av forlenget tid under isofluran. Annet enn tiden under anestesi, var den vanligste komplikasjonen av kirurgi som førte til mors død manglende evne til å telte bukhinnen riktig mens du gjorde hud- og bukhinnesnittene. Hvis bukhinnen ikke er riktig telt, kan tarmene bli skadet, noe som kan føre til død i dagene etter operasjonen. Tiden livmoren er utsatt påvirker også overlevelsen av dammen og embryoer. Gjennomsnittlig tid livmoren ble eksponert i vellykkede eksperimenter var ca. 15 min; Over 30 min eksponering kan føre til økt resorpsjon og mulig mors sykdom. Den eksponerte livmoren og andre eksponerte organer (ofte tarmene) må holdes fuktige, men for mye saltvann kan avkjøle dyret; Ved periodisk fukting av de eksponerte organene, bør mindre enn 1 ml steril saltoppløsning brukes.
Parametrene for injeksjon og elektroporering påvirket embryooverlevelsen sterkt. Injeksjonsvolumet bør ikke overskride ca. 4,5 μl, da dette resulterte i resorpsjoner. Injeksjonstid og trykk er viktig for å maksimere overlevelsen; Injeksjonstiden skulle settes mellom 0,5 s og 1,5 s, selv om 0,8 s syntes optimal. Trykket skal settes mellom 1-8,5 psi. Lav embryooverlevelse ble sett med lave injeksjonstider og høye injeksjons-PSI-nivåer. Det ble også observert at hvis mikropipetten var for stump, kunne det være en reduksjon i embryonal levedyktighet, og løsningen vil også ofte lekke ut av mikropipetten. Den type fargestoff som brukes til å visualisere injeksjoner kan påvirke overlevelse. Metylenblå førte til mors død når den ble brukt til dette formålet, men en filtrert Fast Green fargestoffløsning viste ingen negativ innvirkning på mors helse. Elektroporeringsinnstillingene ble optimalisert fra de anbefalte produsentinnstillingene basert på tidligere elektroporasjonsstudier in vivo33. Elektroporering ble funnet å være manipulasjonen som forårsaket mest skade og redusert embryooverlevelse. De anbefalte in vivo embryoelektroporasjonsinnstillingene foreslår fire pulser for å maksimere CRISPR-effektiviteten, men to pulser anbefales for en høyere overlevelsesrate33. Det ble funnet at fire pulser forårsaket nesten alle embryoene til å resorbere. To pulser muliggjorde økt levedyktighet samtidig som CRISPR-effektiviteten ble opprettholdt. Størrelsen på elektroporasjonspadlen påvirket også embryooverlevelsen betydelig. Det ble funnet at 5 mm elektroporasjonspadler førte til nesten fullstendig resorpsjon når de ble brukt med de anbefalte innstillingene. Faktisk anbefales 3 mm elektroporasjonspadler i produsentens veiledning og øker embryoets levedyktighet betydelig33. Det er også viktig å merke seg at mange elektroporasjonspadler har visse pulsliv. Etter at de har blitt brukt til dette maksimumet, kan en reduksjon i kvalitet sees. Dette kan identifiseres hvis det ikke dannes et lite hvitt skum mellom padlene og morkaken under en puls. Elektroporasjonspadlespenningen kan kontrolleres ved hjelp av et voltmeter for å avgjøre om den produserer den forventede spenningen.
Denne studien er begrenset på flere måter. Denne teknikken er tidsspesifikk og utføres sannsynligvis best tidligst E10.5 og senest E16.5. Dette skyldes at morkaken er for liten før E10.5, og etter E16.5 kan det hende at plasmidet ikke har nok tid til å gi ønsket effekt. Denne tidsrammen betyr at denne teknikken er bedre egnet for spesifikke typer studier på mus. Denne teknikken er nyttig for å studere nevroutvikling, da E12.5 faller innenfor en avgjørende tid for nevrogenese for mange strukturer i hjernen34. Denne teknikken kan ikke være nyttig for å studere placentapåvirkninger på de tidlige utviklingsstadiene, for eksempel nevralplatedannelse, som finner sted på E8.535. Resultatene av et knockout CRISPR-plasmid er ikke kjent på dette tidspunktet; Anvendelsen av denne metoden til genuttrykksreduksjon trenger ytterligere undersøkelser, da bare overekspresjon / aktivering av et gen har blitt påvist. Til tross for dette forventes det at denne teknikken også vil lykkes for innsetting av et knockout CRISPR-plasmid.
Denne teknikken kan også tillate muligheten for å utføre en primærkultur av genetisk modifisert placentavev36. Avhengig av hvilken type CRISPR som brukes, som CRISPRi og CRISPRa, kan en primærkultur brukes til å utføre en redningsstudie37,38. Denne teknikken kan også brukes til å utforske sammenhenger mellom placenta genetiske og funksjonelle abnormiteter og problemer hos avkom. Spesielt fant en tidligere studie en signifikant korrelasjon mellom placental-spesifikke genomiske risikoscore og schizofrenirisiko39. Denne studien identifiserte mange placentaskener som kan spille en rolle i schizofreniutvikling som ikke har blitt utforsket i dyremodeller. Denne teknikken egner seg til videre studier av denne typen og andre.
Kunnskapen fra CRISPR-modifikasjon av morkaken kan oversettes til en rekke forskjellige biomedisinske applikasjoner. Studier som identifiserer hvordan spesifikt genuttrykk i morkaken kan påvirke fosterutviklingen, kan brukes til å skape placental-målrettede farmakologiske inngrep som kan behandle disse abnormiteter. Behandlinger rettet direkte mot et foster kan være vanskelig og farlig40,41. Morkaken er et mer tilgjengelig mål for behandling. I tilfelle av utviklingsproblemer i hjertet eller hjernen som kan være modifiserbar prenatalt, er direkte hjerte- eller hjernemanipulasjon høy risiko. Slik risiko kan unngås med placentaintervensjon, noe som er mer sannsynlig og kan føre til forebyggende strategier for nevroutviklingsforstyrrelser der det molekylære miljøet, som delvis er gitt av morkaken, kan være kritisk5. Denne teknikken kan også brukes til å behandle sykdommer som medfødt hjertesykdom, som har vært knyttet til placentaforstyrrelser9. Siden medfødt hjertesykdom er en vanlig fødselsdefekt, kan muligheten for placentaintervensjonsbehandling ha en betydelig innvirkning8. Siden morkaken har mange funksjoner, kan denne teknikken brukes til å fremme utviklingen av intervensjoner for flere sykdommer. Samlet sett kan denne placenta målrettede teknikken brukes til å fremme forståelsen av påvirkning av placenta genetikk og funksjon på flere områder av fosterutvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner følgende finansieringskilder: R01 MH122435, NIH T32GM008629 og NIH T32GM145441. Forfatterne takker Dr. Val Sheffield og Dr. Calvin Carters laboratorier ved University of Iowa for bruken av deres operasjonsrom og utstyr, samt Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan og Dr. Matthew Weber for deres hjelp med mikroskopi. Forfatterne takker også Dr. Sara Maurer, Maya Evans og Sreelekha Kundu for deres hjelp med pilotoperasjonene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 - 44 - 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/? |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24x60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
References
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S.
- Maslen, C. L.
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T.
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
- Smajdor, A.
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
