Vi beskriver en metod för att effektivt separera retinal pigmentepitel (RPE) från näthinnan i mänskliga ögon och generera hela RPE/choroid flatmounts för histologiska och morfometriska analyser av RPE.
Retinal pigmentepitel (RPE) och näthinnan är funktionellt och strukturellt anslutna vävnader som arbetar tillsammans för att reglera ljusuppfattning och syn. Proteiner på RPE-apikalytan är tätt associerade med proteiner på fotoreceptorns yttre segmentyta, vilket gör det svårt att konsekvent separera RPE från fotoreceptorerna / näthinnan. Vi utvecklade en metod för att effektivt separera näthinnan från RPE för mänskliga ögon för att generera kompletta RPE / choroid- och retina-flatmounts för separat cellulär analys av fotoreceptorerna och RPE-cellerna. En intravitreal injektion av en lösning med hög osmolaritet av D-mannitol, ett socker som inte transporteras av RPE, inducerade separationen av RPE och näthinnan över hela den bakre kammaren utan att orsaka skador på RPE-cellkorsningarna. Inga RPE-plåster observerades fästa vid näthinnan. Falloidinmärkning av aktin visade RPE-formbevarande och möjliggjorde morfometrisk analys av hela epitelet. En artificiell intelligens (AI) -baserad programvara utvecklades för att exakt känna igen och segmentera RPE-cellgränserna och kvantifiera 30 olika formmätvärden. Denna dissektionsmetod är mycket reproducerbar och kan enkelt utvidgas till andra djurmodeller.
Retinal pigmentepitel (RPE) och neural retina är starkt sammankopplade med varandra på grund av fotoreceptorernas starka fysiologiska beroende av RPE. Under dissektion orsakar den mekaniska separationen av den neurala näthinnan från RPE rivning av RPE-cellerna, med de apikala delarna av RPE kvar fästa vid de yttre segmenten av retinala fotoreceptorer. Omfattningen av RPE-retinal vidhäftning är så stor att mängden pigment som finns kvar på näthinnan efter separation används för att kvantifiera styrkan hos retinal vidhäftning1. Specifikt bryts RPE täta korsningar och aktinstrukturen som förbinder dem, som ligger på den apikala sidan, av under mekanisk separation. Därför resulterar färgning av RPE-flatmounts för cellgränser i ett ojämnt monolager där många celler saknar gränser. Denna effekt förvärras när vävnaden fixeras med paraformaldehyd (PFA) före dissektion, eftersom proteinerna blir tvärbundna.
Studier på intravitreal läkemedelstillförsel har visat att injektioner av hyperosmotiska lösningar i den bakre kammaren inducerar näthinneavlossning 2,3. I dessa experiment orsakade 50 μL av olika lösningar, allt från 1 000 mOsm till 2 400 mOsm, injicerad i mitten av glaskroppen näthinneavlossning inom några minuter. Noterbart är att även efter långa exponeringar för lösningar med hög osmolaritet verkade RPE-täta korsningar intakta i överföringselektronmikroskopiska bilder av både kanin- och apögon3. Efter en liknande strategi injicerade vi i mitten av glaskroppen en hyperosmotisk lösning av D-mannitol för att inducera en effektiv retinalavskiljning innan vi utför RPE-dissektion. Eftersom D-mannitol inte transporteras av RPE4 upprätthålls en hög intravitreal koncentration, vilket genererar en osmotisk gradient. Den effektiva separationen av RPE och näthinnan över hela den bakre kammaren garanterar bevarandet av RPE-cellulära korsningar och möjliggör studier av RPE-morfometri på hela plattfästet. Dessutom utvecklade vi en artificiell intelligens (AI)-baserad programvara som känner igen och segmenterar fluorescerande märkta RPE-cellgränser, kvantifierar 30 olika formmått och producerar värmekartor för varje mått för visualisering 5,6.
Den konsekventa och effektiva separationen av mänsklig RPE och näthinnor kan uppnås med hjälp av detta protokoll. Denna metod möjliggör studier av regionala skillnader i RPE-form över hela mänskliga näthinnor5. Ett viktigt steg i protokollet är den fysiska separationen av RPE och näthinnan. Om de två vävnaderna inte är helt lossnade i vissa områden, bör man försiktigt lyfta näthinnan och se till att inte bryta vävnaderna. REShAPE-analysen av stora flatmounts kan kräva användning av system med betydande RAM-resurser. I det här fallet kan återmonteringen av hela bilden inaktiveras så att programvaran framgångsrikt kan slutföra analysen trots brist på bearbetningsresurser.
Den huvudsakliga begränsningen med att använda REShAPE för att segmentera mänskliga RPE-flatmounts är att AI-algoritmen mestadels tränades på bilder av inducerad pluripotent stamcellsbaserad RPE. Som en konsekvens är segmenteringen av mänskliga RPE-flatmounts mindre exakt. RPE-celler från åldrade givare innehåller en stor mängd lipofuscin7, och det breda spektrumet av dess autofluorescens stör cellgränssegmenteringen. I framtiden kommer fler bilder av RPE-flatmounts att användas för att förbättra cellgränssegmenteringen i denna typ av prov. Trots denna begränsning utbildades REShAPE specifikt för att känna igen och segmentera RPE-cellgränser och presterar bättre än andra befintliga metoder, såsom Voronoi8 och CellProfiler9-segmentering av RPE-celler.
Dessutom, jämfört med manuell segmentering 10, ger REShAPE fördelen att analysera stora bilder snabbt (~ 130 000 pixlar x130 000 pixlar testades). Sammanfattningsvis är denna dissektionsmetod mycket reproducerbar och kan enkelt utvidgas till andra djurmodeller. Dessutom kan programvaran användas för att studera RPE-form i ögonflator eller i cellodlingsmodeller för att undersöka effekten av vissa behandlingar. Slutligen gör REShAPE: s mångsidighet det i stort sett tillämpligt för analys av andra typer av epitelceller.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar National Eye Institute (NEI) histologikärna för användningen av Zeiss Axio Scan.Z1. Vi tackar också givarna, deras familjer, Advancing Sight Network och Lions Eye Institute för deras generositet. Detta arbete stöddes av NEI IRP-medel (bidragsnummer ZIA EY000533-04).
Biopsy punch 1.5 mm | Acuderm Inc. | P1525 | |
Bovine albumin | MP Biomedicals | 160069 | |
Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness | Brain Research Laboratories | 5075-1.5D | |
Curved spatula | Katena | K3-6600 | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 14040-133 | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14558-11 | |
Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm | Brain Research Laboratories | 5075 | |
Needles 21 G x 1-1/2" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305167 | |
Needles 27 G x 1-1/4" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305136 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Petri dish 100 mm | Corning | 430167 | |
Phalloidin-iFluor 647 | Abcam | ab176759 | |
Razor blades | PAL (Personna) | 62-0177 | |
Round bottom tubes 50 mL | Newegg | 9SIA4SR9M88854 | |
Silicon Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm) | Sigma | W2876 | |
Surgical Vitrectomy System | BD Visitrec | 585100 | optional |
Syringe 1 mL | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
TrueBlack | Biotium | 23007 | autofluorescence quencher |
Tween 20 | Affymetrix | 20605 | |
Vannas Spring Scissors – 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-10 |