우리는 인간의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE)를 효율적으로 분리하고 RPE의 조직 학적 및 형태 측정 분석을 위해 전체 RPE / 맥락막 플랫 마운트를 생성하는 방법을 설명합니다.
망막 색소 상피(RPE)와 망막은 기능적으로나 구조적으로 연결된 조직으로 함께 작동하여 빛의 지각과 시력을 조절합니다. RPE 정점 표면의 단백질은 광수용체 외부 세그먼트 표면의 단백질과 밀접하게 연관되어 있어 RPE를 광수용체/망막에서 일관되게 분리하기 어렵습니다. 우리는 광수용체와 RPE 세포의 별도의 세포 분석을 위해 완전한 RPE/맥락막 및 망막 플랫마운트를 생성하기 위해 인간의 눈의 RPE에서 망막을 효율적으로 분리하는 방법을 개발했습니다. RPE에 의해 운반되지 않는 당인 D-만니톨의 고삼투압 용액의 유리체내 주사는 RPE 세포 접합부에 손상을 주지 않으면서 전체 후실에 걸쳐 RPE와 망막의 분리를 유도했습니다. 망막에 부착된 RPE 패치는 관찰되지 않았습니다. 액틴의 팔로이딘 표지는 RPE 모양 보존을 나타내고 전체 상피의 형태 측정 분석을 허용했습니다. 인공 지능(AI) 기반 소프트웨어는 RPE 셀 경계를 정확하게 인식 및 분할하고 30가지 모양 메트릭을 정량화하기 위해 개발되었습니다. 이 해부 방법은 재현성이 높으며 다른 동물 모델로 쉽게 확장 할 수 있습니다.
망막 색소 상피 (RPE)와 신경 망막은 RPE에 대한 광 수용체의 강한 생리적 의존성 때문에 서로 강하게 상호 연결되어 있습니다. 해부 중에 RPE에서 신경 망막의 기계적 분리는 RPE 세포의 찢어짐을 유발하고 RPE의 정점 부분은 망막 광 수용체의 외부 세그먼트에 부착되어 있습니다. RPE-망막 접착의 정도가 너무 커서 분리 후 망막에 남아있는 색소의 양이 망막 접착의 강도를 정량화하는 데사용됩니다1. 특히, RPE 단단한 접합부와이를 연결하는 액틴 구조는 정점에 위치하여 기계적 분리 중에 끊어집니다. 따라서 세포 경계에 대해 RPE 플랫마운트를 염색하면 많은 세포에 테두리가 누락된 고르지 못한 단층이 생성됩니다. 이 효과는 단백질이 가교됨에 따라 해부 전에 조직이 파라 포름 알데히드 (PFA)로 고정 될 때 악화됩니다.
유리체 내 약물 전달에 대한 연구에 따르면 후실에 고 삼투압 용액을 주사하면 망막 박리가 유도됩니다 2,3. 이 실험에서 1,000mOsm에서 2,400mOsm 범위의 50μL의 서로 다른 용액을 유리체 중간에 주입하면 몇 분 안에 망막 박리가 발생했습니다. 특히, 고 삼투압 용액에 장시간 노출 된 후에도 RPE 단단한 접합은 토끼와 원숭이 눈3의 투과 전자 현미경 이미지에서 손상되지 않은 것으로 나타났습니다. 유사한 전략에 따라 RPE 해부를 수행하기 전에 효율적인 망막 박리를 유도하기 위해 D-만니톨의 고삼투압 용액을 중간 유리체에 주입했습니다. D-만니톨이 RPE4에 의해 수송되지 않기 때문에, 높은 유리체내 농도가 유지되어 삼투압 구배를 생성한다. 전체 후실에서 RPE와 망막의 효율적인 분리는 RPE 세포 접합부의 보존을 보장하고 전체 플랫마운트에서 RPE 형태 측정을 연구할 수 있도록 합니다. 또한 형광 표지된 RPE 세포 경계를 인식 및 분할하고, 30개의 서로 다른 모양 메트릭을 정량화하고, 시각화 5,6을 위한 각 메트릭의 히트맵을 생성하는 인공 지능(AI) 기반 소프트웨어를 개발했습니다.
인간 RPE와 망막의 일관되고 효율적인 분리는 이 프로토콜을 사용하여 달성할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 전체 인간 망막에서 RPE 모양의 지역적 차이를 연구 할 수 있습니다5. 프로토콜에서 중요한 단계는 RPE와 망막의 물리적 분리입니다. 두 조직이 일부 영역에서 완전히 분리되지 않은 경우 망막을 부드럽게 들어 올려 조직이 부러지지 않도록해야합니다. 대형 플랫마운트의 REShAPE 분석에는 상당한 RAM 리소스가 있는 시스템을 사용해야 할 수 있습니다. 이 경우 전체 이미지의 리어셈블리를 비활성화하여 처리 리소스가 부족함에도 불구하고 소프트웨어가 분석을 성공적으로 완료할 수 있습니다.
REShAPE를 사용하여 인간 RPE 플랫마운트를 분할할 때의 주요 한계는 AI 알고리즘이 대부분 유도만능줄기세포 유래 RPE의 이미지에 대해 훈련되었다는 것입니다. 결과적으로 인간 RPE 플랫마운트의 세분화는 덜 정확합니다. 노화 된 기증자의 RPE 세포에는 다량의 lipofuscin7이 포함되어 있으며자가 형광의 광범위한 스펙트럼은 세포 경계 분할을 방해합니다. 앞으로 RPE 플랫마운트의 더 많은 이미지가 이러한 종류의 샘플에서 세포 경계 분할을 개선하는 데 사용될 것입니다. 이러한 한계에도 불구하고 REShAPE는 RPE 세포 경계를 인식하고 분할하도록 특별히 훈련되었으며 RPE 세포의 Voronoi8 및 CellProfiler9 분할과 같은 다른 기존 방법보다 더 나은 성능을 발휘합니다.
또한 수동 분할 10에 비해 REShAPE는 큰 이미지를 빠르게 분석할 수 있는 이점을 제공합니다(~130,000픽셀 x130,000픽셀 테스트 완료). 결론적으로,이 해부 방법은 재현성이 높으며 다른 동물 모델로 쉽게 확장 할 수 있습니다. 또한 이 소프트웨어를 사용하여 아이 플랫마운트 또는 세포 배양 모델에서 RPE 모양을 연구하여 특정 치료의 효과를 검사할 수 있습니다. 마지막으로, REShAPE의 다양성은 다른 유형의 상피 세포 분석에 광범위하게 적용 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
Zeiss Axio Scan.Z1을 사용해 주신 NEI(National Eye Institute) 조직학 코어에 감사드립니다. 또한 기부자, 그 가족, 전진 시력 네트워크 및 라이온스 안과 연수회에 대한 관대함에 감사드립니다. 이 작업은 NEI IRP 기금 (보조금 번호 ZIA EY000533-04)의 지원을 받았습니다.
Biopsy punch 1.5 mm | Acuderm Inc. | P1525 | |
Bovine albumin | MP Biomedicals | 160069 | |
Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness | Brain Research Laboratories | 5075-1.5D | |
Curved spatula | Katena | K3-6600 | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 14040-133 | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14558-11 | |
Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm | Brain Research Laboratories | 5075 | |
Needles 21 G x 1-1/2" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305167 | |
Needles 27 G x 1-1/4" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305136 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Petri dish 100 mm | Corning | 430167 | |
Phalloidin-iFluor 647 | Abcam | ab176759 | |
Razor blades | PAL (Personna) | 62-0177 | |
Round bottom tubes 50 mL | Newegg | 9SIA4SR9M88854 | |
Silicon Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm) | Sigma | W2876 | |
Surgical Vitrectomy System | BD Visitrec | 585100 | optional |
Syringe 1 mL | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
TrueBlack | Biotium | 23007 | autofluorescence quencher |
Tween 20 | Affymetrix | 20605 | |
Vannas Spring Scissors – 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-10 |