在研究细胞培养实验室中避免真菌和细菌污染的细胞培养技术和实践

Summary

该协议介绍了研究细胞培养实验室中使用的基本细胞培养技术和实践，以避免真菌和细菌污染。在细菌类别中，将特别强调防止支原体污染。

Abstract

细胞培养是在受控环境中生长人类、动物和昆虫细胞或其他组织所必需的一项精细技能。该协议的目标是强调研究实验室中使用的正确技术，以防止真菌和细菌污染。特别强调避免支原体污染，这是细胞培养室的一个主要问题，因为它体积小，对用于细胞培养的大多数抗生素具有抗性。这些相同的技术可确保持续生长并保持健康的细胞。对于新的和有经验的细胞培养用户，始终如一地遵守这些最佳实践以降低污染风险非常重要。实验室应每年审查一次细胞培养最佳实践，并在需要时进行讨论或额外培训。与污染发生后进行清理相比，尽早采取行动防止污染将节省时间和金钱。通用的最佳实践可保持细胞培养的健康，从而减少不断解冻新细胞的需要，购买昂贵的细胞培养基，并减少培养箱净化和停机时间。

Introduction

细胞培养在研究实验室中有许多用途。自20世纪初细胞培养起源以来，细胞系一直帮助推动科学发展。细胞系有几个优点;各种细胞系可以帮助研究人员研究细胞生物学，产生杆状病毒用于进一步研究，或产生大量感兴趣的蛋白质，仅^举几例1。一些额外的用途包括研究组织生长，帮助推进疫苗开发，毒理学研究，研究基因在健康生物体和患病模型中的作用，以及杂交^{细胞系的生产}2^，3。细胞系还可以实现药物生产³。使用细胞系时，需要适当的无菌技术;本手稿中概述的实践和技术适用于进行细胞培养工作的研究实验室。其他实验室设置不讨论。

在进行细胞培养工作时，污染通常是主要关注的问题。在本文中，污染通常是指真菌和细菌。本文概述的方法的总体目标是全面描述避免污染的最佳实践。所有实验室成员在研究实验室的细胞培养室工作时都应遵守这些做法。实验室应确保所有工人积极参与使用这些最佳实践来防止污染。正确的实践和技术知识将有助于确保细胞培养物保持活力、健康和不受污染。该技术的发展基于文献研究、七年的细胞培养经验，以及对新手和经验丰富的细胞培养工作者每年都可以参考的方法的需求。

需要一种清晰、标准化的技术，所有研究细胞培养实验室都应遵循。许多关于细胞培养污染的文献讨论了支原体的检测、无菌技术、污染源、污染物的消除以及通过使用抗生素和^{定期检测进行}预防4，⁵，⁶，^7，8。虽然这些信息很有帮助，但文献中没有视频来展示应该遵循的正确细胞培养技术。与其他技术相比，所介绍的做法的优势在于专注于在污染发生之前防止污染，而不是在以后发现和纠正错误。此外，无菌技术的全面演示、关于防止真菌和细菌生长的讨论以及有关生物安全柜气流的信息对于新手和有经验的细胞培养工作者都很有价值。

细菌和真菌是两种最常见的污染物类型。在细菌类别中，支原体是一个主要问题，因为它体积小，能够增殖而不被注意。它们是自我复制的生物，没有依靠真核细胞生长的刚性细胞壁。尽管透射电子显微镜可以检测到支原体⁹，¹⁰，但它们的代谢能力降低，并且可以大量繁殖^，同时在细胞培养物的常规目视检查和定期显微镜分析中仍未被识别。此外，它们可以通过微生物过滤器¹⁰。细胞培养基为支原体提供营养，但不幸的是，用抗生素补充培养基不会影响支原体¹⁰。应该注意的是，一般来说，没有必要用抗生素补充培养基;适当的技术应该足以防止污染。支原体感染不会导致细胞立即死亡，但研究人员担心它会影响数据的可重复性和质量。

所有实验室人员应严格遵守良好的细胞培养规范。培养物应在新购买后、当前生长期间、冷冻保存前以及从液氮^2，10 解冻时检测支原体。市场上有不同的测试，使用聚合酶链反应（PCR），酶联免疫吸附测定（ELISA）或免疫染色。³ 文献表明，“人分离株占细胞培养中发现的支原体污染物的很大一部分”⁵。尽管已经描述了200多种支原体，但其中约6种占大多数感染。这六个物种是 M. arginini、M. fermentans、M. hominis、M. hyorhinis、M. oral 和 Acholeplasma laidlawii¹⁰。与其他类型的污染一样，空气和气溶胶将这些污染物带入细胞培养物⁵。这在其他论文中得到了回应，因为“人类操作员可能是实验室中最大的危险”⁷。虽然这是通过人为错误完成的，但如果遵循标准程序，则可以消除风险。人员脱落不仅限于支原体污染;一个实验室中的细胞培养物通常感染相同的支原体物种，这表明由于不正确的细胞培养技术，污染从一个烧瓶扩散到另一个烧瓶¹⁰。

防止交叉污染也是应遵循适当的细胞培养技术的另一个原因。值得注意的是，全球至少有15%-18%的细胞系可能被交叉污染或错误识别^11，12。除了测试细胞系的支原体污染外，还应测试它们的交叉污染¹⁰。对于人类细胞系，通过一种称为短串联重复（STR）分析的廉价基于DNA的技术进行细胞系鉴定是当前的国际参考标准，因为它是确认细胞系身份的简单方法²，^10，13，14。STR可以识别错误标记或交叉污染的细胞系，但不能检测不正确的组织来源¹⁰，^13，14。如果细胞系被错误标记、错误识别或污染，研究数据的有效性可能会受到损害¹³.与其他类型的污染类似，由于技术不佳导致气溶胶扩散，错误接触导致错误的细胞类型进入烧瓶，或使用相同的培养基瓶和具有不同细胞系的试剂，可能会发生交叉污染¹⁰。不应共享媒体瓶;在两个不同的细胞系之间共享一瓶培养基可以使这些细胞群混合，导致生长更快的细胞类型完全接管烧瓶。这种替换并不明显，会导致标签错误和错误识别².如果在处理或标记过程中培养物混淆，则也可能将细胞系误认为另一种细胞系¹⁰。应特别注意将试剂、培养基和培养瓶彼此分开。每个实验室成员都应该有自己的培养基瓶;实验室成员之间不应进行共享。细胞系本身应从合格的细胞库和供应商处购买。实验室不应共用细胞。研究表明，尽管经常使用STR和支原体检测，但文献中的许多研究论文已经使用了错误识别或污染的细胞系¹⁵。筛选研究以找到这些有问题的论文并追溯告知读者此事是很麻烦的。预防是确保此问题不会首先发生的最佳方法。

喷洒含有70%EtOH的物品的简单动作即可杀死生物体;70%的EtOH通过使蛋白质变性和溶解最常见的污染生物（包括细菌和真菌）中的脂质起作用¹⁶。研究表明，70%是最有效的浓度;表面蛋白不会与70%的EtOH快速凝结，因此它们可以进入细胞，而它所含的水是蛋白质变性过程所必需的。由于细胞壁两侧的水和酒精的浓度差异，70%的EtOH进入细胞使酶和结构蛋白变性。如果在烧瓶中观察到霉菌生长，则必须首先用70%EtOH喷洒并擦干整个培养箱，然后在60°C下孵育16小时过夜¹⁷。这可以杀死大多数霉菌和任何细菌。

与在污染发生后消除污染的替代技术相比，预防措施的主要优势在于，通过及早预防污染，实验室工作人员可以确保他们的细胞培养物是健康的，并且不会有与培养箱净化或丢弃细胞培养物相关的高成本。例如，消除支原体污染物后效率不高⁷.尽早花时间确保实验室人员接受适当的培训，细胞培养室是独立的，并使用标准程序将节省时间和金钱。

Protocol

1. 准备工作 常规穿着干净的实验室外套，指定仅在细胞培养室穿着，不得在实验室的其他部分穿着。注意：实验室外套不需要无菌。 戴上未接触任何其他表面的新手套。确保手套紧贴。丁腈、无粉手套是最好的。注意：手套不需要无菌。 为了准备工作，用70%的EtOH喷洒手套，实验室衣套和生物安全柜的内部。用不起毛的纸巾擦干工作表面和玻璃面…

Representative Results

如果不遵循本文中概述的正确细胞培养技术和实践，研究细胞培养实验室可能会受到真菌和细菌的污染。 图2 显示了悬浮液和贴壁培养物中含有污染物的培养瓶。 如果不遵循无菌技术，2-3天后可能会发生霉菌污染。悬浮细胞中漂浮在培养基中的圆形绒毛球很明显，而附着细胞中的霉菌生长可以观察到大块、不规则、白色或绿色斑块。 <p class="jove_conten…

Discussion

虽然污染是进行细胞培养工作时的主要问题之一，但本手稿中概述的实践和技术将有助于降低风险。关键步骤包括穿着干净的实验室外套，仅在细胞培养室使用，使用干净的无粉手套，这些手套经常喷洒70%EtOH，并在细胞系之间切换时更换，鼓励每个人不要共用培养基瓶，在完成工作之前和之后彻底清洁机柜， 整齐地打开血清移液器，避免长时间密切接触打开的瓶子或烧瓶，不要在多个细胞系之?…

Materials

DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques