Técnicas e práticas de cultura celular para evitar a contaminação por fungos e bactérias no laboratório de cultura de células de pesquisa

Summary

Este protocolo apresenta técnicas e práticas essenciais de cultura de células a serem utilizadas no laboratório de cultura de células de pesquisa para evitar a contaminação por fungos e bactérias. Dentro da categoria de bactérias, será dada ênfase especial à prevenção da contaminação por micoplasmas.

Abstract

A cultura de células é uma habilidade delicada necessária para o crescimento de células humanas, animais e de insetos, ou outros tecidos, em um ambiente controlado. O objetivo do protocolo é enfatizar as técnicas corretas utilizadas em um laboratório de pesquisa para evitar a contaminação por fungos e bactérias. Ênfase especial é dada à prevenção da contaminação por micoplasma, uma grande preocupação na sala de cultura celular devido ao seu pequeno tamanho e resistência à maioria dos antibióticos usados para cultura celular. Essas mesmas técnicas garantem o crescimento contínuo e mantêm as células saudáveis. Para usuários de cultura de células novos e experientes, é importante aderir consistentemente a essas práticas recomendadas para mitigar o risco de contaminação. Uma vez por ano, os laboratórios devem rever as melhores práticas de cultura celular e fazer o acompanhamento com uma discussão ou treinamento adicional, se necessário. Tomar medidas precoces para evitar a contaminação em primeiro lugar economizará tempo e dinheiro, em comparação com a limpeza após a contaminação ocorrer. As melhores práticas universais mantêm as culturas de células saudáveis, reduzindo assim a necessidade de descongelar constantemente novas células, comprar meios de cultura de células caros e reduzir a quantidade de descontaminação e tempo de inatividade da incubadora.

Introduction

A cultura de células tem muitos usos no laboratório de pesquisa. Desde as origens da cultura de células no início do século 20, as linhagens celulares ajudaram a avançar a ciência. As linhagens celulares têm várias vantagens; Várias linhagens celulares podem ajudar os pesquisadores a estudar a biologia celular, produzir baculovírus para estudos posteriores ou produzir grandes quantidades de uma proteína de interesse, para citar alguns¹. Alguns usos adicionais incluem o estudo do crescimento tecidual, ajudando a avançar o desenvolvimento de vacinas, a pesquisa toxicológica, o estudo do papel de genes em organismos saudáveis e modelos doentes, e a produção de linhagens celulares híbridas ^2,3. As linhagens celulares também podem possibilitar a produção de fármacos³. Técnicas assépticas adequadas são necessárias ao trabalhar com linhagens celulares; As práticas e técnicas descritas neste manuscrito são aplicáveis aos laboratórios de pesquisa onde o trabalho de cultura celular é realizado. Outros cenários laboratoriais não são discutidos.

A contaminação é muitas vezes a principal preocupação ao realizar o trabalho de cultura celular. No contexto deste artigo, a contaminação geralmente se refere a fungos e bactérias. O objetivo geral do método descrito neste artigo é descrever detalhadamente as melhores práticas para evitar a contaminação. Todos os membros do laboratório devem aderir a essas práticas ao trabalhar na sala de cultura celular de um laboratório de pesquisa. Os laboratórios devem garantir que todos os trabalhadores participem ativamente no uso dessas melhores práticas para evitar a contaminação. O conhecimento das práticas e técnicas corretas ajudará a garantir que as culturas de células permaneçam viáveis, saudáveis e livres de contaminação. O desenvolvimento dessa técnica é baseado em pesquisas da literatura, sete anos de experiência trabalhando com culturas de células e a necessidade de um método ao qual tanto novatos quanto experientes em cultura de células possam se referir anualmente.

Há necessidade de uma técnica clara e padronizada que todos os laboratórios de cultura de células de pesquisa devem seguir. Grande parte da literatura sobre contaminação em cultura celular discute a detecção de micoplasma, técnicas assépticas, fontes de contaminação, eliminação de contaminantes, prevenção por meio de antibióticos e testes regulares 4,5,6,7,8. Embora essas informações sejam úteis, não há vídeos presentes na literatura que demonstrem as técnicas adequadas de cultura celular que se deve seguir. A vantagem das práticas apresentadas sobre as técnicas alternativas é o foco na prevenção da contaminação antes que ela aconteça, em vez de detectar e corrigir erros posteriormente. Além disso, uma demonstração completa de técnicas assépticas, uma discussão sobre a prevenção do crescimento de fungos e bactérias e informações sobre o fluxo de ar do gabinete de biossegurança são valiosas tanto para trabalhadores iniciantes quanto experientes em cultura de células.

Bactérias e fungos são os dois tipos mais comuns de contaminantes. Dentro da categoria de bactérias, o micoplasma é uma grande preocupação devido ao seu pequeno tamanho e capacidade de proliferar enquanto permanece despercebido. São organismos auto-replicantes, sem parede celular rígida, que dependem de células eucarióticas para crescer. Apresentam capacidades metabólicas reduzidas e podem se multiplicar muito, permanecendo não reconhecidos na inspeção visual rotineira de culturas de células e análises microscópicas regulares, embora a microscopia eletrônica de transmissão possa detectar^{micoplasma9,10}. Além disso, podem passar através de filtros microbiológicos¹⁰. O meio de cultura celular fornece nutrientes ao micoplasma, embora, infelizmente, a suplementação do meio com antibióticos não afete o^micoplasma10. Deve-se notar que, em geral, não é necessário suplementar os meios com antibióticos; Técnicas adequadas devem ser suficientes para manter a contaminação afastada. A infecção por micoplasma não leva à morte celular imediata, mas é preocupante para os pesquisadores, pois afeta a reprodutibilidade e a qualidade dos dados.

Todo o pessoal do laboratório deve aderir estritamente às boas práticas de cultura celular. As culturas devem ser testadas para micoplasma após a compra recente, enquanto estão sendo cultivadas, antes da criopreserva e quando descongeladas a partir de nitrogênio líquido ^2,10. Diferentes testes estão disponíveis no mercado usando reação em cadeia da polimerase (PCR), ensaio imunoenzimático (ELISA) ou imunomarcação. ³ A literatura indica que “isolados humanos representam uma grande porcentagem dos contaminantes de micoplasma encontrados em cultura celular”⁵. Embora mais de 200 espécies de micoplasma tenham sido descritas, cerca de seis delas são responsáveis pela maioria das infecções. Essas seis espécies são M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale e Acholeplasma laidlawii¹⁰. Assim como outros tipos de contaminação, o ar e os aerossóis os trazem para as culturas celulares⁵. Isso encontra eco em outros trabalhos, uma vez que o “operador humano é potencialmente o maior perigo em laboratório”⁷. Embora isso seja feito através de erro humano, o risco pode ser eliminado se um procedimento padrão for seguido. A eliminação de pessoal não se restringe apenas à contaminação por micoplasma; Culturas de células em um laboratório geralmente estão infectadas com a mesma espécie de micoplasma, indicando que a contaminação se espalha de um frasco para outro devido a técnicas inadequadas de cultura celular¹⁰.

A prevenção da contaminação cruzada também é outra razão pela qual técnicas adequadas de cultura celular devem ser seguidas. Observa-se que pelo menos 15%–18% das linhagens celulares no mundo podem estar contaminadas ou mal identificadas^11,12. Além de testar linhagens celulares para contaminação por micoplasma, elas também devem ser testadas para contaminação cruzada¹⁰. Para linhagens celulares humanas, a autenticação de linhagens celulares por uma técnica barata baseada em DNA chamada short tandem repeat (STR) profiling é o padrão de referência internacional atual, pois é uma maneira fácil de confirmar a identidade da linhagem celular 2,10,13,14. A RTS pode identificar linhagens celulares marcadas incorretamente ou contaminadas cruzadamente, mas não pode detectar origem tecidual incorreta^10,13,14. A validade dos dados de pesquisa pode ser comprometida se linhagens celulares forem rotuladas incorretamente, identificadas erroneamente ou contaminadas¹³. Assim como outros tipos de contaminação, a contaminação cruzada pode ocorrer devido à má técnica que provoca a disseminação de aerossóis, ao contato equivocado que leva à entrada do tipo de célula errado em um frasco, ou ao uso do mesmo frasco e reagentes com linhagens celulares diferentes¹⁰. Não deve ocorrer compartilhamento de garrafas de mídia; O compartilhamento de um frasco de mídia entre duas linhagens celulares diferentes pode permitir que essas populações de células sejam misturadas, levando o tipo de célula de crescimento mais rápido a assumir completamente o frasco. Essa substituição não é perceptível e leva a erros de rotulagem e identificação². Uma linhagem celular também pode ser confundida com outra se as culturas forem confundidas durante o manuseio ou marcação¹⁰. Deve-se prestar muita atenção para manter reagentes, meios e frascos separados uns dos outros. Cada membro do laboratório deve ter seus próprios frascos de mídia; Nenhum compartilhamento deve ocorrer entre os membros do laboratório. As próprias linhas celulares devem ser compradas de um banco de células qualificado e provedor. Os laboratórios não devem compartilhar células. Estudos mostram que, embora os testes de STR e micoplasma sejam regularmente utilizados, muitos trabalhos de pesquisa na literatura já utilizaram linhagens celulares mal identificadas ou^{contaminadas15}. Examinar a pesquisa para encontrar esses artigos problemáticos e informar retroativamente os leitores sobre esse assunto é complicado. A prevenção é a melhor maneira de garantir que esse problema não ocorra em primeiro lugar.

A simples ação de pulverizar itens com 70% de EtOH pode matar organismos; A EtOH a 70% atua desnaturando proteínas e dissolvendo lipídios nos organismos mais comumente contaminantes, incluindo bactérias e fungos¹⁶. Estudos têm mostrado que 70% é a concentração mais eficaz; As proteínas de superfície não coagulam rapidamente com 70% de EtOH para que possam entrar na célula, enquanto a água que contém é necessária para o processo de desnaturação das proteínas. Devido à diferença de concentração de água e álcool em ambos os lados da parede celular, 70% de EtOH entra na célula para desnaturar proteínas enzimáticas e estruturais. Se o crescimento de mofo for observado nos frascos, toda a incubadora deve ser descontaminada pulverizando-a primeiro com EtOH 70% e limpando-a, seguida de uma incubação noturna de 16 h a 60 °C¹⁷. Isso mata a maioria dos mofos e quaisquer bactérias.

A principal vantagem das práticas de prevenção sobre as técnicas alternativas de eliminação da contaminação após sua ocorrência é que, prevenindo a contaminação precocemente, os trabalhadores de laboratório podem ter certeza de que suas culturas de células estão saudáveis e não haverá altos custos associados à descontaminação de incubadoras ou ao descarte de culturas celulares. A eliminação de contaminantes de micoplasma após, por exemplo, não ser eficiente⁷. Dedicar tempo desde o início para garantir que o pessoal do laboratório seja devidamente treinado, a sala de cultura de células seja autocontida e um procedimento padrão seja usado economizará tempo e dinheiro.

Protocol

1. Preparações GeralUse um jaleco limpo designado para ser usado apenas na sala de cultura de células e nenhuma outra parte do laboratório.NOTA: O jaleco não precisa ser estéril. Use luvas novas que não tenham tocado em nenhuma outra superfície. Certifique-se de que as luvas se encaixam bem. Luvas sem nitrilo e sem pó são as melhores.NOTA: As luvas não precisam ser estéreis. Para se preparar para o trabalho, borrife as luvas, as mangas do jalec…

Representative Results

Se as técnicas e práticas adequadas de cultura celular descritas neste trabalho não forem seguidas, a contaminação por fungos e bactérias pode ocorrer no laboratório de cultura de células de pesquisa. A Figura 2 mostra os frascos contendo contaminação tanto na suspensão quanto na cultura aderida. Quando não segue técnicas assépticas, a contaminação por mofo pode ocorrer de 2 a 3 dias depois. Bolas fuzzy redondas flutuando na mídia são perceptíve…

Discussion

Embora a contaminação seja uma das principais preocupações ao realizar o trabalho de cultura de células, as práticas e técnicas descritas neste manuscrito ajudarão a mitigar os riscos. As etapas críticas incluem o uso de um jaleco limpo, que só é usado na sala de cultura celular, o uso de luvas limpas e sem pó que são pulverizadas com 70% de EtOH com frequência e que são trocadas ao alternar entre linhas celulares, incentivando cada indivíduo a não compartilhar frascos de mídia, limpando o armário cuid…

Materials

DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques