Zellkulturtechniken und -praktiken zur Vermeidung von Kontaminationen durch Pilze und Bakterien im Forschungszellkulturlabor

Summary

Dieses Protokoll stellt wesentliche Zellkulturtechniken und -praktiken vor, die im Forschungszellkulturlabor angewendet werden sollen, um eine Kontamination durch Pilze und Bakterien zu vermeiden. Innerhalb der Kategorie der Bakterien wird besonderer Wert auf die Vermeidung einer Mykoplasmenkontamination gelegt.

Abstract

Zellkultur ist eine heikle Fähigkeit, die notwendig ist, um menschliche, tierische und Insektenzellen oder andere Gewebe in einer kontrollierten Umgebung zu züchten. Das Ziel des Protokolls ist es, die richtigen Techniken hervorzuheben, die in einem Forschungslabor verwendet werden, um eine Kontamination durch Pilze und Bakterien zu verhindern. Besonderer Wert wird auf die Vermeidung einer Mykoplasmenkontamination gelegt, die aufgrund ihrer geringen Größe und Resistenz gegen die meisten Antibiotika, die für die Zellkultur verwendet werden, ein wichtiges Anliegen im Zellkulturraum ist. Dieselben Techniken sorgen für ein kontinuierliches Wachstum und erhalten gesunde Zellen. Sowohl für neue als auch für erfahrene Anwender von Zellkulturen ist es wichtig, sich konsequent an diese Best Practices zu halten, um das Risiko einer Kontamination zu mindern. Einmal im Jahr sollten die Labore die Best Practices für Zellkulturen überprüfen und bei Bedarf eine Diskussion oder zusätzliche Schulungen durchführen. Frühzeitiges Ergreifen von Maßnahmen, um eine Kontamination von vornherein zu verhindern, spart Zeit und Geld im Vergleich zur Reinigung nach einer Kontamination. Universelle Best Practices halten Zellkulturen gesund und reduzieren so die Notwendigkeit, ständig neue Zellen aufzutauen, teure Zellkulturmedien zu kaufen und die Dekontamination und Ausfallzeiten des Inkubators zu reduzieren.

Introduction

Die Zellkultur hat viele Verwendungsmöglichkeiten im Forschungslabor. Seit den Anfängen der Zellkultur im frühen 20. Jahrhundert haben Zelllinien dazu beigetragen, die Wissenschaft voranzubringen. Zelllinien haben mehrere Vorteile; Verschiedene Zelllinien können Forschern helfen, die Zellbiologie zu untersuchen, Baculoviren für weitere Studien zu produzieren oder große Mengen eines Proteins von Interesse zu produzieren, um nur einige zu nennen¹. Zu den weiteren Anwendungen gehören die Untersuchung des Gewebewachstums, die Förderung der Impfstoffentwicklung, die toxikologische Forschung, die Untersuchung der Rolle von Genen in gesunden Organismen und Krankheitsmodellen sowie die Herstellung von Hybridzelllinien ^2,3. Zelllinien können auch die Herstellung von Medikamenten ermöglichen³. Bei der Arbeit mit Zelllinien sind geeignete aseptische Techniken erforderlich. Die in diesem Manuskript beschriebenen Praktiken und Techniken sind auf Forschungslabore anwendbar, in denen Zellkulturen durchgeführt werden. Andere Laborumgebungen werden nicht diskutiert.

Kontamination ist oft das Hauptanliegen bei der Durchführung von Zellkulturarbeiten. Im Zusammenhang mit dieser Arbeit bezieht sich der Begriff Kontamination im Allgemeinen auf Pilze und Bakterien. Das übergeordnete Ziel der in diesem Dokument beschriebenen Methode besteht darin, die Best Practices zur Vermeidung von Kontaminationen gründlich zu beschreiben. Alle Labormitglieder sollten sich an diese Praktiken halten, wenn sie im Zellkulturraum eines Forschungslabors arbeiten. Labore sollten sicherstellen, dass alle Mitarbeiter aktiv an der Anwendung dieser bewährten Verfahren zur Vermeidung von Kontaminationen beteiligt sind. Das Wissen über die richtigen Praktiken und Techniken trägt dazu bei, dass Zellkulturen lebensfähig, gesund und frei von Verunreinigungen bleiben. Die Entwicklung dieser Technik basiert auf Literaturrecherchen, sieben Jahren Erfahrung in der Arbeit mit Zellkulturen und der Notwendigkeit einer Methode, auf die sowohl Anfänger als auch erfahrene Zellkulturarbeiter jährlich zurückgreifen können.

Es besteht ein Bedarf an einer klaren, standardisierten Technik, der alle Forschungszellkulturlabore folgen sollten. Ein Großteil der Literatur zur Kontamination von Zellkulturen befasst sich mit dem Nachweis von Mykoplasmen, aseptischen Techniken, Kontaminationsquellen, der Beseitigung von Verunreinigungen und der Prävention durch den Einsatz von Antibiotika und regelmäßigen Tests 4,5,6,7,8. Obwohl diese Informationen hilfreich sind, gibt es in der Literatur keine Videos, die die richtigen Zellkulturtechniken demonstrieren, die man befolgen sollte. Der Vorteil der vorgestellten Praktiken gegenüber alternativen Techniken besteht darin, dass der Schwerpunkt darauf liegt, eine Kontamination zu verhindern, bevor sie auftritt, anstatt Fehler später zu erkennen und zu korrigieren. Darüber hinaus sind eine gründliche Demonstration aseptischer Techniken, eine Diskussion über die Verhinderung von Pilz- und Bakterienwachstum sowie Informationen über den Luftstrom in Biosicherheitswerkbänken sowohl für Anfänger als auch für erfahrene Zellkulturmitarbeiter wertvoll.

Bakterien und Pilze sind die beiden häufigsten Arten von Verunreinigungen. Innerhalb der Bakterienkategorie sind Mykoplasmen aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer Fähigkeit, sich unbemerkt zu vermehren, ein großes Problem. Es handelt sich um sich selbst replizierende Organismen ohne starre Zellwand, die auf eukaryotische Zellen angewiesen sind, um zu wachsen. Sie haben eine reduzierte Stoffwechselfähigkeit und können sich stark vermehren, während sie bei der routinemäßigen visuellen Inspektion von Zellkulturen und der regelmäßigen mikroskopischen Analyse unerkannt bleiben, obwohl die Transmissionselektronenmikroskopie Mykoplasmen nachweisen kann ^9,10. Darüber hinaus können sie mikrobiologische Filter¹⁰ passieren. Zellkulturmedium versorgt Mykoplasmen mit Nährstoffen, obwohl die Ergänzung mit Antibiotika leider keinen Einfluss auf Mykoplasmen^{hat 10}. Es ist zu beachten, dass es im Allgemeinen nicht notwendig ist, Medien mit Antibiotika zu ergänzen. Geeignete Techniken sollten ausreichen, um eine Kontamination in Schach zu halten. Eine Infektion mit Mykoplasmen führt nicht zum sofortigen Zelltod, ist aber für Forscher besorgniserregend, da sie die Reproduzierbarkeit und Qualität der Daten beeinträchtigt.

Das gesamte Laborpersonal sollte sich strikt an gute Zellkulturpraktiken halten. Kulturen sollten nach dem Neukauf, während der Zucht, vor der Kryokonservierung und nach dem Auftauen aus flüssigem Stickstoff auf Mykoplasmen getestet werden ^2,10. Auf dem Markt sind verschiedene Tests erhältlich, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder Immunfärbung verwenden. ³ In der Literatur wird darauf hingewiesen, dass “menschliche Isolate einen großen Prozentsatz der in Zellkultur gefundenen Mykoplasmenkontaminanten ausmachen”⁵. Obwohl mehr als 200 Mykoplasmenarten beschrieben wurden, sind etwa sechs davon für die meisten Infektionen verantwortlich. Bei diesen sechs Arten handelt es sich um M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale und Acholeplasma laidlawii¹⁰. Wie bei anderen Arten von Kontaminationen werden diese durch Luft und Aerosole in Zellkulturen eingebracht⁵. Dies wird auch in anderen Arbeiten wiederholt, da der “menschliche Bediener potenziell die größte Gefahr im Labor darstellt^“7. Obwohl dies durch menschliches Versagen geschieht, kann das Risiko eliminiert werden, wenn ein Standardverfahren befolgt wird. Die Ausscheidung des Personals beschränkt sich nicht nur auf die Kontamination mit Mykoplasmen. Zellkulturen in einem Labor sind in der Regel mit denselben Mykoplasmenarten infiziert, was darauf hindeutet, dass sich die Kontamination aufgrund unsachgemäßer Zellkulturtechniken von einem Kolben zum anderen ausbreitet¹⁰.

Die Vermeidung von Kreuzkontaminationen ist auch ein weiterer Grund, warum geeignete Zellkulturtechniken befolgt werden sollten. Es wird darauf hingewiesen, dass mindestens 15 % bis 18 % der Zelllinien weltweit kreuzkontaminiert oder falsch identifiziert sein können^11,12. Neben der Untersuchung von Zelllinien auf Mykoplasmenkontamination sollten sie auch auf Kreuzkontamination getestet werden¹⁰. Für menschliche Zelllinien ist die Zelllinienauthentifizierung durch eine kostengünstige DNA-basierte Technik, die als Short Tandem Repeat (STR)-Profiling bezeichnet wird, der aktuelle internationale Referenzstandard, da es eine einfache Möglichkeit ist, die Identität der Zelllinie zu bestätigen 2,10,13,14. Die STR kann falsch markierte oder kreuzkontaminierte Zelllinien identifizieren, aber keinen falschen Gewebeursprung^{nachweisen 10,13,14}. Die Aussagekraft von Forschungsdaten kann beeinträchtigt werden, wenn Zelllinien falsch markiert, falsch identifiziert oder kontaminiert werden¹³. Ähnlich wie bei anderen Arten von Kontaminationen kann eine Kreuzkontamination aufgrund einer schlechten Technik auftreten, die zur Ausbreitung von Aerosolen führt, eines irrtümlichen Kontakts, der dazu führt, dass der falsche Zelltyp in einen Kolben gelangt, oder der Verwendung derselben Medienflasche und derselben Reagenzien mit unterschiedlichen Zelllinien¹⁰. Es sollte keine gemeinsame Nutzung von Medienflaschen erfolgen. Durch die gemeinsame Nutzung einer Flasche Medium zwischen zwei verschiedenen Zelllinien können diese Zellpopulationen gemischt werden, was dazu führt, dass der schneller wachsende Zelltyp den Kolben vollständig übernimmt. Dieser Austausch ist nicht wahrnehmbar und führt zu falscher Etikettierung und falscher Identifizierung². Eine Zelllinie kann auch mit einer anderen verwechselt werden, wenn Kulturen während der Handhabung oder Markierung^{verwechselt werden 10}. Es sollte sorgfältig darauf geachtet werden, Reagenzien, Medien und Kolben getrennt voneinander aufzubewahren. Jedes Labormitglied sollte seine eigenen Medienflaschen haben. Es sollte keine Freigabe zwischen Lab-Mitgliedern erfolgen. Die Zelllinien selbst sollten von einer qualifizierten Mobilfunkbank und einem qualifizierten Anbieter erworben werden. Labore sollten keine Zellen gemeinsam nutzen. Studien zeigen, dass, obwohl STR- und Mykoplasmentests regelmäßig verwendet werden, in vielen Forschungsarbeiten in der Literatur bereits falsch identifizierte oder kontaminierte Zelllinien verwendet wurden¹⁵. Es ist umständlich, die Recherchen zu durchforsten, um diese problematischen Papiere zu finden und die Leser nachträglich über dieses Thema zu informieren. Prävention ist der beste Weg, um sicherzustellen, dass dieses Problem gar nicht erst auftritt.

Das einfache Besprühen von Gegenständen mit 70 % EtOH kann Organismen abtöten. 70 % EtOH wirkt, indem es Proteine denaturiert und Lipide in den am häufigsten kontaminierenden Organismen, einschließlich Bakterien und Pilzen, auflöst¹⁶. Studien haben gezeigt, dass 70 % die effektivste Konzentration ist; Oberflächenproteine koagulieren nicht schnell mit 70% EtOH, so dass sie in die Zelle eindringen können, während das darin enthaltene Wasser für den Denaturierungsprozess von Proteinen notwendig ist. Aufgrund des Konzentrationsunterschieds von Wasser und Alkohol auf beiden Seiten der Zellwand gelangen 70 % EtOH in die Zelle, um sowohl enzymatische als auch Strukturproteine zu denaturieren. Wenn Schimmelbildung in Kolben beobachtet wird, muss der gesamte Inkubator dekontaminiert werden, indem er zunächst mit 70 % EtOH besprüht und trocken gewischt wird, gefolgt von einer 16-stündigen Inkubationszeit über Nacht bei 60 °C¹⁷. Dies tötet die meisten Schimmelpilze und Bakterien ab.

Der Hauptvorteil von Präventionspraktiken gegenüber alternativen Techniken zur Beseitigung von Kontaminationen im Nachhinein besteht darin, dass Labormitarbeiter durch die frühzeitige Verhinderung von Kontaminationen sicher sein können, dass ihre Zellkulturen gesund sind und keine hohen Kosten mit der Dekontamination von Inkubatoren oder der Entsorgung von Zellkulturen verbunden sind. Die Eliminierung von Mykoplasmenkontaminanten ist z. B. danach nicht effizient⁷. Wenn Sie sich frühzeitig die Zeit nehmen, um sicherzustellen, dass das Laborpersonal richtig geschult ist, der Zellkulturraum in sich geschlossen ist und ein Standardverfahren verwendet wird, sparen Sie Zeit und Geld.

Protocol

1. Vorbereitungen AllgemeinTragen Sie einen sauberen Laborkittel, der nur im Zellkulturraum und nicht in anderen Teilen des Labors getragen werden darf.HINWEIS: Der Laborkittel muss nicht steril sein. Tragen Sie neue Handschuhe, die keine anderen Oberflächen berührt haben. Achten Sie darauf, dass die Handschuhe fest sitzen. Puderfreie Nitrilhandschuhe sind am besten.Anmerkungen: Die Handschuhe müssen nicht steril sein. Um sich auf die Arbeit vorzubereit…

Representative Results

Wenn die in diesem Artikel beschriebenen Zellkulturtechniken und -praktiken nicht befolgt werden, kann es im Forschungszellkulturlabor zu einer Kontamination durch Pilze und Bakterien kommen. Abbildung 2 zeigt Kolben mit Verunreinigungen sowohl in der Suspensions- als auch in der adhärenten Kultur. Wenn keine aseptischen Techniken befolgt werden, kann es 2–3 Tage später zu einer Schimmelpilzkontamination kommen. Runde, unscharfe Kugeln, die im Medium schweben,…

Discussion

Während die Kontamination eines der Hauptanliegen bei der Durchführung von Zellkulturarbeiten ist, werden die in diesem Manuskript beschriebenen Praktiken und Techniken dazu beitragen, die Risiken zu mindern. Zu den kritischen Schritten gehören das Tragen eines sauberen Laborkittels, der nur im Zellkulturraum verwendet wird, die Verwendung sauberer, puderfreier Handschuhe, die häufig mit 70 % EtOH besprüht werden und beim Wechsel zwischen den Zelllinien gewechselt werden, die Ermutigung jedes Einzelnen, Medienflasch…

Materials

DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques