用化学发光法实时检测水稻免疫反应中活性氧的产生
Summary
在这里，我们描述了一种实时检测病原体相关分子模式触发的免疫反应中水稻组织中质外活性氧（ROS）产生的方法。该方法简单、标准化，可在受控条件下产生高度可重复的结果。
Abstract
活性氧（ROS）在各种生物过程中起着至关重要的作用，包括非生物和生物胁迫的传感。在病原体感染或病原体相关化学物质（病原体相关分子模式[PAMP]）攻击时，一系列免疫反应（包括ROS爆发）在植物中迅速诱导，这称为PAMP触发免疫（PTI）。ROS爆发是一种标志性的PTI反应，由一组质膜定位的NADPH氧化酶 – RBOH家族蛋白催化。绝大多数ROS由过氧化氢（H2O2）组成，可以通过基于鲁米诺的化学发光方法轻松稳定地检测。化学发光是一种产生光子的反应，其中鲁米诺或其衍生物（如L-012）在催化剂的作用下与ROS进行氧化还原反应。本文介绍了一种优化的基于L-012的化学发光方法，用于在水稻组织中引发PAMP时实时检测质外体ROS的产生。该方法简单、稳定、标准化，在严格控制的条件下具有高度可重复性。
Introduction
活性氧 （ROS） 包括一系列化学活性氧衍生物，包括超氧阴离子自由基 （O2-） 及其衍生物、羟基自由基 （OH–）、过氧化氢以及单线态氧或氧化还原反应的产物，它们在质体和叶绿体、线粒体、过氧化物酶体和其他亚细胞位置中不断产生1.ROS在许多生物过程中起着重要作用，对所有植物都是必不可少的2，3，4。ROS功能的广泛范围从生长发育的调节到非生物和生物胁迫的感知5，6，7，8。
在植物免疫系统中，植物细胞质膜定位的受体 – 所谓的模式识别受体（PRR） – 感知病原体衍生的化学物质 – 病原体相关分子模式（PAMP）。这种识别触发了一系列快速免疫反应，包括钙内流、ROS 爆发和 MAPK 级联反应;因此，这一层免疫被称为PAMP触发免疫（PTI）。ROS突发是PTI响应的标志性特征，其测定被广泛用于PTI相关研究9，10。由 PAMP 触发的 ROS 产生归因于质膜驻留的 NADPH 氧化酶或呼吸爆发氧化酶同系物 （RBOH） 家族蛋白，其将电子从胞质 NADPH 或 NADH 转移到细胞外氧以产生超氧化物 （O 2–），超氧化物通过超氧化物歧化酶自发转化为过氧化氢 （H 2 O 2）8.PAMP触发的ROS突发非常迅速，在PAMP治疗后几分钟出现，并在~10-12分钟达到峰值。绝大多数ROS分子由过氧化氢（H2O2）组成，可以通过化学发光测定轻松稳定地检测。
在化学发光中，化学发光试剂在催化剂的作用下与活性氧反应，产生激发态中间体。然后，产物中的电子通过非辐射跃迁返回基态并发射光子。常见的化学发光试剂包括鲁米诺和L-012，其中鲁米诺在应用中占主导地位11，12，13。然而，越来越多的研究人员选择L-012来检测ROS的产生，因为与鲁米诺相比，L-012在中性或接近中性的pH条件下具有更高的发光效率。
本文介绍了一种基于L-012的优化化学发光方法，用于实时检测水稻（水稻）组织-叶盘和鞘中PAMPs的产生。本文提供的方法简单、稳定、标准化，适应性强，可满足不同的实验需求。使用这种方法获得的数据在严格控制的条件下具有高度可重复性。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究的目的是建立一种高效的方法来量化水稻组织中PAMP响应的早期ROS产生。该方法为实时测定由处理过的大米组织产生的质外体ROS提供了一种标准化程序。该方法操作简单，成本低，成分清晰，独立于商业试剂盒。使用这种方法，研究人员可以研究植物受到生物或非生物胁迫时质外体ROS的实时产生。
在该协议中，L-012被选为化学发光试剂，因为它是一种无毒化学物质。鲁?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 上海市自然科学基金（批准号：21ZR1429300/BS1500016）、上海交通大学（Agri-X计划，批准号：AF1500088/002）、上海市农业种子协同创新中心（批准号：ZXWH2150201/001）对范江波的资助，以及上海交通大学医学工程合作项目（批准号：21X010301734）对李灿的资助。
Materials
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
References
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