Sanntidsdeteksjon av reaktiv oksygenartsproduksjon i immunrespons i ris med en kjemiluminescensanalyse
Summary
Her beskriver vi en metode for sanntidsdeteksjon av apoplastisk reaktiv oksygenart (ROS) produksjon i risvev i patogenassosiert molekylær mønsterutløst immunrespons. Denne metoden er enkel, standardisert og genererer svært reproduserbare resultater under kontrollerte forhold.
Abstract
Reaktive oksygenarter (ROS) spiller viktige roller i en rekke biologiske prosesser, inkludert sensing av abiotiske og biotiske påkjenninger. Ved patogeninfeksjon eller utfordring med patogenassosierte kjemikalier (patogenassosierte molekylære mønstre [PAMPs]), induseres en rekke immunresponser, inkludert et ROS-utbrudd, raskt i planter, som kalles PAMP-utløst immunitet (PTI). Et ROS-utbrudd er en kjennetegnet PTI-respons, som katalyseres av en gruppe plasmamembranlokaliserte NADPH-oksidaser – RBOH-familieproteinene. Det store flertallet av ROS består av hydrogenperoksid (H 2 O2), som enkelt og jevnt kan detekteres ved en luminolbasert kjemiluminescensmetode. Kjemiluminescens er en fotonproduserende reaksjon hvor luminol, eller dets derivat (slik som L-012), gjennomgår en redoksreaksjon med ROS under virkningen av en katalysator. Denne artikkelen beskriver en optimalisert L-012-basert kjemiluminescensmetode for å oppdage apoplast ROS-produksjon i sanntid ved PAMP-fremkalling i risvev. Metoden er enkel, stødig, standardisert og svært reproduserbar under godt kontrollerte forhold.
Introduction
Reaktive oksygenarter (ROS) omfatter en serie kjemisk aktive oksygenderivater, inkludert superoksidanionradikaler (O2-) og dets derivater, hydroksylradikaler (OH–), hydrogenperoksid og produkter av singlet oksygen eller oksidasjonsreduksjonsreaksjoner, som kontinuerlig produseres i plastider og kloroplaster, mitokondrier, peroksisomer og andre subcellulære steder1 . ROS spiller viktige roller i mange biologiske prosesser og er avgjørende for alle planter 2,3,4. Det brede spekteret av ROS-funksjoner varierer fra regulering av vekst og utvikling til oppfatningen av abiotiske og biotiske påkjenninger 5,6,7,8.
I planteimmunsystemet oppfatter plantecelleplasmamembranlokaliserte reseptorer – såkalte mønstergjenkjenningsreseptorer (PRR) – patogenavledede kjemikalier-patogenassosierte molekylære mønstre (PAMP). Denne anerkjennelsen utløser en rekke raske immunresponser, inkludert kalsiumtilstrømning, ROS-burst og MAPK-kaskade; Dermed kalles dette immunitetslaget PAMP-utløst immunitet (PTI). ROS-utbrudd er en kjennetegnende PTI-respons, hvis bestemmelse er mye brukt på PTI-relaterte studier 9,10. ROS-produksjon utløst av PAMPs tilskrives plasmamembranresident NADPH-oksidase, eller respiratorisk burst oxidase homolog (RBOH) familieproteiner, som overfører elektroner fra cytosolisk NADPH eller NADH til ekstracellulært oksygen for å produsere superoksid (O 2–) som spontant omdannes til hydrogenperoksid (H 2 O 2) av superoksiddismutase 8 . PAMP-utløst ROS-utbrudd er ganske rask, og vises bare noen få minutter etter PAMP-behandling og topper seg på ~ 10-12 min. De aller fleste ROS-molekylene består av hydrogenperoksid (H2O2), som enkelt og jevnt kan detekteres med en kjemiluminescensanalyse.
Ved kjemiluminescens reagerer kjemiluminescensreagenset med aktivt oksygen, under virkningen av en katalysator, for å produsere mellomprodukter i eksitert tilstand. Deretter går elektronene i produktet tilbake til grunntilstanden gjennom ikke-strålingsovergang og avgir fotoner. Vanlige kjemiluminescensreagensreagenser inkluderer luminol og L-012, med luminol som dominerer applikasjonen11,12,13. Imidlertid velger flere forskere L-012 for å oppdage ROS-produksjon, siden L-012 har en mye høyere lysutslippseffektivitet under nøytrale eller nær nøytrale pH-forhold sammenlignet med luminol.
Denne artikkelen beskriver en optimalisert kjemiluminescensmetode, basert på L-012, for sanntidsdeteksjon av ROS-produksjon etter fremkalling av PAMP-er i risskiver (Oryza sativa) vevsbladskiver og kappe. Metoden som tilbys her er enkel, stabil og standardisert, og er svært tilpasningsdyktig for å møte ulike eksperimentelle behov. Dataene oppnådd med denne metoden er svært reproduserbare under fast kontrollerte forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med denne studien var å etablere en svært effektiv metode for å kvantifisere tidlig ROS-produksjon som respons på PAMP i risvev. Denne metoden gir en standardisert prosedyre for sanntidsbestemmelse av apoplast ROS produsert fra behandlet risvev. Denne metoden er enkel i drift, lav kostnad, klar i sammensetning og uavhengig av kommersielle sett. Ved hjelp av denne metoden kan forskere studere sanntidsproduksjonen av apoplast ROS når planter blir utsatt for biotiske eller abiotiske påkjenninger.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Shanghai Natural Science Foundation (tilskuddsnummer: 21ZR1429300 / BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (Agri-X-programmet, stipendnummer: AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (tilskuddsnummer: ZXWH2150201/001) til Jiangbo Fan, og av Medical-Engineering Collaboration Project of Shanghai Jiao Tong Univesity (tilskuddsnummer: 21X010301734) til Can Li.
Materials
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
References
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R. ROS are good. Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).
- Gilroy, S., et al. ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
- Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).
- Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).
- Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress. Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).
- Suzuki, N., et al. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Segonzac, C., Zipfel, C. Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria. Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- Hong, D., Joung, H. -. A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -. G. Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).
- Nishinaka, Y., et al. et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).
