インテリジェントハイスループット抗菌感受性試験/ファージスクリーニングシステムの適用と薬剤耐性指数
Summary
ここでは、インテリジェントなハイスループット抗菌感受性試験/ファージスクリーニングシステムの原理、構造、および指示を紹介します。その応用例は、中国山東省の家禽から分離された サルモネラ菌 を例にとります。Lar指数を算出し、薬剤耐性の評価におけるその意義を総合的に論じる。
Abstract
耐性菌に対する抗菌剤感受性試験(AST)およびファージハイスループットスクリーニングの効率を向上させ、検出コストを削減するために、AST基準および臨床検査基準協会(CLSI)によって策定された耐性ブレークポイント(R)に従って、96ドットマトリックス接種器、画像取得コンバーター、および対応するソフトウェアを含むインテリジェントなハイスループットAST/ファージスクリーニングシステムが開発されました。中国山東省の家禽から分離された1,500株の サルモネラ 菌株のASTおよび最小発育阻害濃度(MIC)分布(R / 8から8R)の統計を、10の抗菌剤に対してインテリジェントなハイスループットAST/ファージスクリーニングシステムによって実施しました。Lar指数は、「抗生物質が少なく、耐性が少なく、抗生物質がほとんどなくなるまで残存する」という意味で、各MICの加重平均を計算し、Rで割ることによって得られました。このアプローチは、耐性菌株の抗菌薬耐性(AMR)の程度を特徴付けるために耐性の有病率を使用する場合と比較して、精度が向上します。AMRの高い サルモネラ 菌株については、このシステムによりファージライブラリーから溶解性ファージを効率的にスクリーニングし、溶解スペクトルを計算および分析しました。その結果、インテリジェントなハイスループットAST/ファージスクリーニングシステムは、操作性、精度、高効率、安価、メンテナンス性が高いことが示されました。山東省の獣医用抗菌薬耐性モニタリングシステムと組み合わせることで、AMRに関連する科学研究や臨床検出に適していました。
Introduction
細菌性感染症の予防に抗菌薬が広く用いられる中、薬剤耐性(AMR)は世界的な公衆衛生上の問題となっています1。AMRとの闘いは、疫学的病原体のAMRのモニタリングと、感受性抗菌剤と溶解性バクテリオファージの相乗療法の現在の主要な使命です2。
in vitro 抗菌薬感受性試験(AST)は、治療のモニタリングとAMRレベルの検出の主力です。抗菌薬理学の重要な部分であり、臨床薬学の重要な基盤です。米国の臨床検査基準協会(CLSI)と欧州抗菌剤感受性試験委員会(EUCAST)は、ASTの国際基準を策定および改訂し、ASTメソッドとブレークポイントを継続的に修正および補足して、特定の「生物-抗菌剤」の組み合わせのMICを感受性(S)、耐性(R)、または中間体(I)として決定しました3。4.
1980年代から1990年代にかけて、Alfred 60AST、VITEK System、PHOENIXTM、Cobasbact 5,6,7などの例で、自動マイクロブロス希釈装置が急速に開発され、臨床診療に適用されました。しかし、これらの機器は高価で、高コストの消耗品が必要であり、その検出範囲は臨床患者の投薬用に設計されていました5,6,7。これらの理由から、獣医の臨床検査や大量の高耐性株の検出には適していません。本研究では、96ドットマトリックス接種装置(図1)、画像取得コンバーター(図2)、および対応するソフトウェア8を含むインテリジェントなハイスループットAST/ファージスクリーニングシステムを開発し、寒天希釈法により複数の抗菌剤に対して一度に細菌株のバッチのASTを実施しました。さらに、このシステムは、薬剤耐性菌に対するファージの溶解パターンの検出と分析にも使用され9、ファージライブラリーから溶解性ファージを効率的に選択しました。このシステムは、効率的で、手頃な価格で、操作が簡単であることがわかりました。
図1:96ドットマトリックス接種器の構造図。 1:接種ピンプレート。2:携帯電話会社;3:シードブロック;4:インキュベートプレート;5:ベース;6:操作ハンドル;7:リミットピン。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:画像取得コンバータの構造図。 1:シェル;2:表示画面;3:画像取得室。4:検出板基盤;5:倉庫の内外の検出板;6:コントロールボード;7:画像取得変換装置と、8:光源;9:イメージスキャナー。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
寒天希釈法は確立されており、広く使用されています。ハイスループットASTシステムの原理は寒天希釈法の原理であった。プロトコル内の重要なステップの1つは、一度に96個の接種者を正確かつハイスループットで移送することで、これを複数回連続して実行しました。この重要なステップを完了するために、96ドットマトリックス接種器のピンは均一で非常に滑らかでした。各ピンの自然?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国家重点研究開発プロジェクト(2019YFA0904003)の支援を受けました。山東省の現代農業産業システム(SDAIT-011-09);国際協力プラットフォーム最適化プロジェクト(CXGC2023G15)中国山東省農業科学院農業科学技術イノベーションプロジェクトの主なイノベーション課題(CXGC2023G03)。
Materials
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , (2022).
- Yuqing, L., et al. . Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- Liu, Y., et al. A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. , (2019).
- Liu, Y. A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. , (2022).
- Adams, M. H. . Bacteriophages. , (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- . . Shandong veterinary antibiotic resistance system. , (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
