التطور السريع لدوائر تحديد حالة الخلية باستخدام النقل المتعدد
Summary
تستغرق الدوائر الجينية المعقدة وقتا طويلا لتصميمها واختبارها وتحسينها. لتسهيل هذه العملية ، يتم نقل خلايا الثدييات بطريقة تسمح باختبار قياسات متكافئة متعددة لمكونات الدائرة في بئر واحد. يحدد هذا البروتوكول خطوات التخطيط التجريبي والنقل وتحليل البيانات.
Abstract
أظهرت الدوائر الوراثية للثدييات القدرة على استشعار وعلاج مجموعة واسعة من الحالات المرضية ، لكن تحسين مستويات مكونات الدائرة لا يزال يمثل تحديا ويتطلب عمالة مكثفة. لتسريع هذه العملية ، طور مختبرنا النقل المتعدد ، وهو امتداد عالي الإنتاجية لنقل الثدييات التقليدي. في poly-transfection ، تقوم كل خلية في السكان المنقولين بشكل أساسي بإجراء تجربة مختلفة ، واختبار سلوك الدائرة بأرقام نسخ مختلفة من الحمض النووي والسماح للمستخدمين بتحليل عدد كبير من القياسات المتكافئة في تفاعل وعاء واحد. حتى الآن ، تم إثبات عمليات النقل المتعددة التي تعمل على تحسين نسب الدوائر المكونة من ثلاثة مكونات في بئر واحد من الخلايا. من حيث المبدأ ، يمكن استخدام نفس الطريقة لتطوير دوائر أكبر. يمكن تطبيق نتائج النقل المتعدد بسهولة للعثور على النسب المثلى من الحمض النووي إلى النقل المشترك للدوائر العابرة أو لاختيار مستويات التعبير لمكونات الدائرة لتوليد خطوط خلايا مستقرة.
هنا ، نوضح استخدام النقل المتعدد لتحسين دائرة مكونة من ثلاثة مكونات. يبدأ البروتوكول بمبادئ التصميم التجريبي ويشرح كيف يبني النقل المتعدد على طرق النقل المشترك التقليدية. بعد ذلك ، يتم إجراء نقل متعدد للخلايا ويتبعه قياس التدفق الخلوي بعد بضعة أيام. أخيرا ، يتم تحليل البيانات عن طريق فحص شرائح بيانات قياس التدفق الخلوي أحادي الخلية التي تتوافق مع مجموعات فرعية من الخلايا ذات نسب مكونات معينة. في المختبر ، تم استخدام poly-transfection لتحسين مصنفات الخلايا ، والتغذية المرتدة وأجهزة التحكم في التغذية الأمامية ، والزخارف ثنائية الاستقرار ، وغيرها الكثير. تعمل هذه الطريقة البسيطة والقوية على تسريع دورات التصميم للدوائر الجينية المعقدة في خلايا الثدييات.
Introduction
تقدم مجال البيولوجيا التركيبية للثدييات بسرعة ، من تطوير أجزاء بسيطة من الإحساس والاستجابة في خطوط الخلايا المستزرعة إلى تحسين الشبكات المعقدة من الجينات لمواجهة تحديات العالم الحقيقي في التشخيص والعلاج1. هذه الدوائر المتطورة قادرة على استشعار المدخلات البيولوجية من ملفات تعريف microRNA إلى السيتوكينات إلى أدوية الجزيئات الصغيرة ، وتنفيذ دوائر المعالجة المنطقية بما في ذلك الترانزستورات ومرشحات تمرير النطاق ومفاتيح التبديل والمذبذبات. كما أظهروا نتائج واعدة في النماذج الحيوانية لأمراض مثل السرطان والتهاب المفاصل والسكري وغيرها الكثير1،2،3،4،5. ومع ذلك ، مع نمو تعقيد الدائرة ، يصبح تحسين مستويات كل مكون من مكوناتها أمرا صعبا بشكل متزايد.
أحد الأنواع المفيدة بشكل خاص من الدوائر الوراثية هو مصنف الخلايا ، والذي يمكن برمجته لاستشعار الحالات الخلوية والاستجابة لها. يعد الإنتاج الانتقائي لمخرجات البروتين أو الحمض النووي الريبي في حالات خلوية محددة أداة قوية لتوجيه وبرمجة تمايز الخلايا والكائنات العضوية ، وتحديد وتدمير الخلايا المريضة و / أو أنواع الخلايا غير المرغوب فيها ، وتنظيم وظيفة الخلايا العلاجية1،2،3،4،5. ومع ذلك ، فإن إنشاء دوائر في خلايا الثدييات يمكنها تصنيف حالات الخلايا بدقة من أنواع متعددة من الحمض النووي الريبي الخلوي و / أو أنواع البروتين كان أمرا صعبا للغاية.
تتمثل إحدى الخطوات الأكثر استهلاكا للوقت في تطوير دائرة تصنيف الخلية في تحسين مستويات التعبير النسبية للجينات المكونة الفردية ، مثل أجهزة الاستشعار وعوامل المعالجة ، داخل الدائرة. لتسريع تحسين الدوائر والسماح ببناء دوائر أكثر تطورا ، استخدم العمل الأخير النمذجة الرياضية لدوائر تصنيف الخلايا ومكوناتها للتنبؤ بالتركيبات والطوبولوجيا المثلى 6,7. في حين أن هذا أظهر نتائج قوية حتى الآن ، فإن التحليل الرياضي محدود بسبب الحاجة إلى توصيف سلوك المدخلات والمخرجات للجينات المكونة في الدائرة بشكل منهجي ، وهو ما يستغرق وقتا طويلا. علاوة على ذلك ، يمكن أن يظهر عدد لا يحصى من المشكلات المعتمدة على السياق في الدوائر الجينية المعقدة ، مما يتسبب في سلوك دائرة كاملة لتحدي التنبؤات بناء على توصيفات الأجزاء الفردية 8,9.
لتطوير واختبار دوائر الثدييات المعقدة بسرعة أكبر مثل مصنفات حالة الخلية ، طور مختبرنا تقنية تسمى poly-transfection10 ، وهي تطور لبروتوكولات النقل المشترك للبلازميد. في النقل المشترك ، يتم تعقيد أنواع متعددة من الحمض النووي البلازميد مع كاشف دهني أو بوليمر موجب الشحنة ، ثم يتم تسليمه إلى الخلايا بطريقة مترابطة (الشكل 1 أ). في النقل المتعدد ، يتم تعقيد البلازميدات بشكل منفصل مع الكاشف ، بحيث يتم تسليم الحمض النووي من كل مركب نقل إلى الخلايا بطريقة غير مترابطة (الشكل 1 ب). باستخدام هذه الطريقة ، تتعرض الخلايا داخل السكان المنقولين لمجموعات عديدة من نسب حمولتين أو أكثر من الحمض النووي تحمل مكونات دائرة مختلفة.
لقياس نسب مكونات الدائرة التي يتم تسليمها إلى كل خلية ، يحتوي كل مركب نقل داخل متعدد النقل على مراسل فلوري معبر عنه بشكل أساسي يعمل كوكيل للامتصاص الخلوي للمجمع. يتم استخدام الحمض النووي للحشو الذي لا يحتوي على أي عناصر نشطة داخل خلية الثدييات لضبط الكمية النسبية لمراسل الفلورسنت ومكونات الدائرة التي يتم تسليمها إلى خلية في مجمع نقل واحد ويتم مناقشته بمزيد من التفصيل في المناقشة. مثال على الحمض النووي للحشو المستخدم في مختبر فايس هو البلازميد الذي يحتوي على تسلسل الفاصل ، ولكن لا يوجد مروج ، تسلسل ترميز ، إلخ. يمكن بعد ذلك مقارنة الخلايا ذات النسب المختلفة لمكونات الدائرة لإيجاد النسب المثلى لوظيفة الدائرة الجينية. وهذا بدوره يعطي تنبؤات مفيدة لاختيار المروجين وعناصر الدائرة الأخرى لتحقيق مستويات التعبير الجيني المثلى عند الجمع بين مكونات الدائرة في ناقل واحد للتكامل الجيني (على سبيل المثال ، فيروس lentivirus أو transposon أو منصة الهبوط). وبالتالي ، بدلا من اختيار النسب بين مكونات الدائرة بناء على الحدس أو عبر عملية التجربة والخطأ التي تستغرق وقتا طويلا ، يقوم النقل المتعدد بتقييم مجموعة واسعة من القياسات المتكافئة بين الأجزاء الجينية في تفاعل وعاء واحد.
في مختبرنا ، مكن النقل المتعدد من تحسين العديد من الدوائر الجينية ، بما في ذلك مصنفات الخلايا ، والتغذية المرتدة وأجهزة التحكم في التغذية الأمامية ، والزخارف ثنائية الاستقرار. هذه الطريقة البسيطة والقوية تسرع بشكل كبير دورات التصميم للدوائر الجينية المعقدة في خلايا الثدييات. ومنذ ذلك الحين ، تم استخدام النقل المتعدد لتوصيف العديد من الدوائر الجينية للكشف عن وظائف نقل المدخلات والمخرجات متعددة الأبعاد بدقةعالية 10 ، وتحسين طوبولوجيا الدائرة البديلة لتصنيف حالة الخلية11 ، وتسريع مختلف المشاريعالمنشورة 12،13 والمشاريع الجارية.
هنا نصف ونصور سير العمل لاستخدام النقل المتعدد لتحسين الدائرة الجينية بسرعة (الشكل 2). يوضح البروتوكول كيفية إنشاء بيانات نقل متعدد عالية الجودة وتجنب العديد من الأخطاء الشائعة في بروتوكول النقل المتعدد وتحليل البيانات (الشكل 3). ثم يوضح كيفية استخدام النقل المتعدد لتوصيف مكونات الدائرة البسيطة ، وفي هذه العملية ، قياس نتائج النقل المتعدد مقابل النقل المشترك (الشكل 4). أخيرا ، تظهر نتائج النقل المتعدد تحسين دائرة مصنف السرطان (الشكل 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
أحدثت طرق النماذج الأولية السريعة مثل التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) وألواح التجارب والطباعة ثلاثية الأبعاد 3D ثورة في تخصصات الهندسة الميكانيكية والكهربائية والمدنية. إن القدرة على البحث بسرعة من خلال العديد من الحلول الممكنة لتحد معين تسرع بشكل كبير من التقدم في مجال ما. نعتقد أن النقل ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أعضاء مختبر فايس السابقين الذين قادوا أو ساهموا في تطوير طريقة النقل المتعدد وتطبيقها على مصنفات الخلايا: جيريمي جام وبري دي أندريث وجين هوه. أعضاء مختبر فايس الآخرين الذين ساهموا في مزيد من تطوير / تحسين الطريقة: Wenlong Xu و Lei Wang و Christian Cuba-Samaniego ؛ البروفيسور جوش ليونارد وأعضاء المجموعة ، بما في ذلك باتريك دوناهو وهيلي إدلشتاين ، لاختبار النقل المتعدد وتقديم الملاحظات ؛ والبروفيسور نيكا شكيبا لدعوته هذه المخطوطة وتقديم ملاحظاته. نود أيضا أن نشكر المعاهد الوطنية للصحة [R01CA173712 ، R01CA207029 ، P50GM098792] ؛ المؤسسة الوطنية للعلوم [1745645]؛ منحة دعم مركز السرطان (الأساسية) [P30CCA14051 ، جزئيا] من المعهد الوطني للسرطان والمعاهد الوطنية للصحة [P50GM098792] لتمويل هذا العمل.
Materials
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
References
- Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
- Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
- Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
- Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
- Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444 (2010).
- Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
- Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
- Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A ‘poly-transfection’ method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
- Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720 (2022).
- Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
- DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).
- Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).
- Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , (2012).
- Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
- Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
- Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
- Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
- Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
- Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
- Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).
