Hurtig udvikling af celletilstandsidentifikationskredsløb med polytransfektion

Summary

Komplekse genetiske kredsløb er tidskrævende at designe, teste og optimere. For at lette denne proces transfekteres pattedyrceller på en måde, der tillader test af flere støkiometrier af kredsløbskomponenter i en enkelt brønd. Denne protokol skitserer trinene til eksperimentel planlægning, transfektion og dataanalyse.

Abstract

Pattedyrs genetiske kredsløb har vist potentialet til at mærke og behandle en bred vifte af sygdomstilstande, men optimering af niveauerne af kredsløbskomponenter forbliver udfordrende og arbejdskrævende. For at fremskynde denne proces udviklede vores laboratorium polytransfektion, en udvidelse med høj kapacitet af traditionel pattedyrtransfektion. I polytransfektion udfører hver celle i den transfekterede population i det væsentlige et andet eksperiment, tester kredsløbets opførsel ved forskellige DNA-kopinumre og giver brugerne mulighed for at analysere et stort antal støkiometrier i en enkeltpottereaktion. Indtil videre er polytransfektioner, der optimerer forholdet mellem trekomponentkredsløb i en enkelt brønd af celler, blevet demonstreret; I princippet kan den samme metode bruges til udvikling af endnu større kredsløb. Polytransfektionsresultater kan let anvendes til at finde optimale forhold mellem DNA og co-transfekt for forbigående kredsløb eller til at vælge ekspressionsniveauer for kredsløbskomponenter til generering af stabile cellelinjer.

Her demonstrerer vi brugen af polytransfektion til at optimere et trekomponentkredsløb. Protokollen begynder med eksperimentelle designprincipper og forklarer, hvordan polytransfektion bygger på traditionelle co-transfektionsmetoder. Derefter udføres polytransfektion af celler og efterfølges af flowcytometri et par dage senere. Endelig analyseres dataene ved at undersøge skiver af enkeltcelleflowcytometridataene, der svarer til delmængder af celler med visse komponentforhold. I laboratoriet er polytransfektion blevet brugt til at optimere celleklassifikatorer, feedback- og feedforward-controllere, bistabile motiver og mange flere. Denne enkle, men kraftfulde metode fremskynder designcyklusser for komplekse genetiske kredsløb i pattedyrceller.

Introduction

Området pattedyrs syntetiske biologi har udviklet sig hurtigt, fra at udvikle enkle sans-og-respons-dele i dyrkede cellelinjer til optimering af komplekse netværk af gener til at løse virkelige udfordringer inden for diagnostik og terapi¹. Disse sofistikerede kredsløb er i stand til at registrere biologiske input fra mikroRNA-profiler til cytokiner til små molekylelægemidler og implementere logiske behandlingskredsløb, herunder transistorer, båndpasfiltre, vippekontakter og oscillatorer. De har også vist lovende resultater i dyremodeller af sygdomme som kræft, gigt, diabetes og mange flere 1,2,3,4,5. Men efterhånden som kompleksiteten af et kredsløb vokser, bliver optimering af niveauerne for hver af dets komponenter stadig mere udfordrende.

En særlig nyttig type genetisk kredsløb er en celleklassifikator, som kan programmeres til at mærke og reagere på cellulære tilstande. Selektiv produktion af protein- eller RNA-output i specifikke cellulære tilstande er et kraftfuldt værktøj til at guide og programmere differentiering af celler og organoider, identificere og ødelægge syge celler og / eller uønskede celletyper og regulere funktionen af terapeutiske celler 1,2,3,4,5 . Imidlertid har det været meget udfordrende at skabe kredsløb i pattedyrceller, der nøjagtigt kan klassificere celletilstande fra flere cellulære RNA- og / eller proteinarter.

Et af de mest tidskrævende trin i udviklingen af et celleklassificeringskredsløb er at optimere de relative ekspressionsniveauer for individuelle komponentgener, såsom sensorer og behandlingsfaktorer, inden for kredsløbet. For at fremskynde kredsløbsoptimering og muliggøre konstruktion af mere sofistikerede kredsløb har nyere arbejde brugt matematisk modellering af celleklassificeringskredsløb og deres komponenter til at forudsige optimale kompositioner og topologier ^6,7. Selvom dette hidtil har vist stærke resultater, er matematisk analyse begrænset af behovet for systematisk at karakterisere input-output-adfærden af komponentgener i kredsløbet, hvilket er tidskrævende. Yderligere kan et utal af kontekstafhængige problemer opstå i komplekse genetiske kredsløb, hvilket får opførelsen af et fuldt kredsløb til at trodse forudsigelser baseret på individuelle delkarakteriseringer ^8,9.

For hurtigere at udvikle og teste komplekse pattedyrkredsløb såsom celletilstandsklassifikatorer udviklede vores laboratorium en teknik kaldet polytransfektion¹⁰, en udvikling af plasmid-co-transfektionsprotokoller. Ved co-transfektion kompleksiseres flere plasmid-DNA-arter sammen med et positivt ladet lipid- eller polymerreagens og leveres derefter til celler på en korreleret måde (figur 1A). Ved polytransfektion kompleksiseres plasmider separat med reagenset, således at DNA’et fra hvert transfektionskompleks leveres til celler på en dekorreleret måde (figur 1B). Ved hjælp af denne metode udsættes celler inden for den transfekterede population for adskillige kombinationer af forhold mellem to eller flere DNA-nyttelaster, der bærer forskellige kredsløbskomponenter.

For at måle forholdet mellem kredsløbskomponenter, der leveres til hver celle, indeholder hvert transfektionskompleks inden for en polytransfektion en konstitutivt udtrykt fluorescerende reporter, der tjener som en proxy for cellulær optagelse af komplekset. Filler-DNA, der ikke indeholder nogen elementer, der er aktive i en pattedyrcelle, bruges til at indstille den relative mængde fluorescerende reporter og kredsløbskomponenter, der leveres til en celle i et enkelt transfektionskompleks og diskuteres mere detaljeret i diskussionen. Et eksempel på fyldstof-DNA, der anvendes i Weiss-laboratoriet, er et plasmid, der indeholder en terminatorsekvens, men ingen promotor, kodende sekvens osv. Celler med forskellige forhold mellem kredsløbskomponenter kan derefter sammenlignes for at finde optimale forhold for genkredsløbsfunktion. Dette giver igen nyttige forudsigelser for valg af promotorer og andre kredsløbselementer for at opnå optimale genekspressionsniveauer, når man kombinerer kredsløbskomponenter i en enkelt vektor til genetisk integration (f.eks. En lentivirus, transposon eller landingsplade). I stedet for at vælge forhold mellem kredsløbskomponenter baseret på intuition eller via en tidskrævende forsøgs- og fejlproces, evaluerer polytransfektion således en bred vifte af støkiometrier mellem genetiske dele i en enkeltpotreaktion.

I vores laboratorium har polytransfektion muliggjort optimering af mange genetiske kredsløb, herunder celleklassifikatorer, feedback- og feedforward-controllere og bistabile motiver. Denne enkle, men kraftfulde metode fremskynder designcyklusser for komplekse genetiske kredsløb i pattedyrceller betydeligt. Polytransfektion er siden blevet brugt til at karakterisere flere genetiske kredsløb for at afsløre deres multidimensionelle input-output overførselsfunktioner ved høj opløsning 10, optimere en alternativ kredsløbstopologi til celletilstandsklassificering¹¹ og fremskynde forskellige offentliggjorte^12,13 og igangværende projekter.

Her beskriver og skildrer vi arbejdsgangen for brug af polytransfektion til hurtigt at optimere et genetisk kredsløb (figur 2). Protokollen viser, hvordan man genererer polytransfektionsdata af høj kvalitet og undgår flere almindelige fejl i polytransfektionsprotokollen og dataanalysen (figur 3). Det demonstrerer derefter, hvordan man bruger polytransfektion til at karakterisere enkle kredsløbskomponenter og i processen benchmarke polytransfektionsresultater mod co-transfektion (figur 4). Endelig viser resultaterne af polytransfektion optimering af kræftklassificeringskredsløbet (figur 5).

Protocol

BEMÆRK: Tabel 1 og tabel 2 tjener som vigtige referencer for denne protokol. Tabel 1 viser reagensskalering for reaktioner, og tabel 2 viser DNA-forholdsaritmetik for et eksempel polytransfektion beskrevet i protokollen (øverste halvdel) og for et muligt opfølgningseksperiment (nederste halvdel). 1. Forberedelse af celler til transfektion Sørg for, at kulturen af humane embryonale nyreceller (HEK…

Representative Results

I figur 1 sammenligner vi co-transfektion med poly-transfektion. I en co-transfektion leveres alle plasmider i den samme transfektionsblanding, hvilket resulterer i høj korrelation mellem mængden af hvert plasmid, som en enkelt celle modtager (figur 1A). Mens antallet af samlede plasmider, der leveres til hver celle, varierer betydeligt, er fluorescensen af de to reporterproteiner i de enkelte celler på tværs af befolkningen godt korreleret, hvilket indikere…

Discussion

Hurtige prototypemetoder som computerstøttet design (CAD), breadboarding og 3D-udskrivning har revolutioneret mekaniske, elektriske og civilingeniørdiscipliner. Evnen til hurtigt at søge gennem mange mulige løsninger på en given udfordring fremskynder i høj grad fremskridt inden for et felt. Vi mener, at polytransfektion er en analog teknologi til biologisk teknik, der muliggør hurtig prototyping af genetiske kredsløb. Derudover kræver andre hurtige prototypeteknologier praktisk sekventiel iteration af flere mul…

Materials

15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI