العزل غير المائي وإثراء الرؤوس الغدية المطاردة واللاطئة من القنب ساتيفا
Summary
يتم تقديم بروتوكول للعزل المريح وعالي الإنتاجية وإثراء الرؤوس الغدية المطاردة و trichomes اللاطئة من Cannabis sativa. يعتمد البروتوكول على استخراج جاف وغير عازل للترايكهومات باستخدام النيتروجين السائل والثلج الجاف والمناخل المصنوعة من النايلون فقط وهو مناسب لاستخراج الحمض النووي الريبي والتحليل النسخي.
Abstract
تقدم هذه الورقة بروتوكولا للعزل المريح وعالي الإنتاجية وإثراء الرؤوس الغدية المطاردة والثلاثية اللاطئة من Cannabis sativa. يتم تحديد مسارات التخليق الحيوي للقنب واستقلاب التربين المتطاير بشكل أساسي في trichomes القنب ، و trichomes المعزولة مفيدة لتحليل النسخ. البروتوكولات الحالية لعزل trichomes الغدية للتوصيف النسخي غير مريحة وتوفر رؤوس trichome للخطر وكمية منخفضة نسبيا من trichomes معزولة. علاوة على ذلك ، يعتمدون على أجهزة باهظة الثمن ووسائط عزل تحتوي على مثبطات البروتين لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي. يقترح البروتوكول الحالي الجمع بين ثلاثة تعديلات فردية للحصول على كمية كبيرة من التريكومات الغدية المعزولة والمطاردة اللاطئة من النورات الأنثوية الناضجة C. sativa وأوراق المروحة ، على التوالي. يتضمن التعديل الأول استبدال النيتروجين السائل بوسط العزل التقليدي لتسهيل مرور الترايكهوم عبر المناخل الدقيقة. يتضمن التعديل الثاني استخدام الثلج الجاف لفصل trichomes عن مصدر النبات. يتضمن التعديل الثالث تمرير المادة النباتية على التوالي من خلال خمسة غرابيل دقيقة ذات أحجام مسام متناقصة. أظهر التصوير المجهري فعالية تقنية العزل لكلا النوعين من الترايشوم. بالإضافة إلى ذلك ، كانت جودة الحمض النووي الريبي المستخرج من trichomes المعزولة مناسبة لتحليل النسخ النهائي.
Introduction
trichomes الغدية هي هياكل تشبه الشعر موجودة في النباتات التي تحتوي على العديد من المستقلبات الثانوية1 وتمثل بنكا قيما لجينات وإنزيمات التخليق الحيوي الجديدة2. في القنب ، يتم توطين التخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية الهامة ، القنب 3 والتربين4 ، في trichomes. بالنظر إلى دور trichomes في تحديد جودة القنب للاستخدامات الطبية والترفيهية على حد سواء ، فإن دراسة التعبير الجيني trichome ذات أهمية. لتوصيف التعبير عن الجينات الخاصة بالتريشومي ، يجب أولا عزل trichomes ذات الأهمية. تم وصف بروتوكولات عزل Trichome لأول مرة في وقت مبكر من عام 19925 ، وقد تمت مراجعة أحدث تطوراتها مؤخرا2. بشكل عام ، يمكن تقسيم بروتوكولات استخراج trichomes الغدية للتوصيف النسخي إلى خطوتين متسلسلتين متميزتين. تتضمن الخطوة الأولى فصلا ماديا شاملا للترايكهوم عن الأنسجة النباتية. يمكن تنفيذ هذه الخطوة باستخدام الثلج الجاف5 ، أو الخرز الزجاجي بجهاز تجاري 6,7 ، أو طحن المادة النباتية مقابل غربال شبكي8 ، أو دوامة الأنسجة النباتية في مخزن عازلللعزل 9. تتضمن الخطوة الثانية فصلا أكثر دقة للترايكهومات ذات الأهمية عن بقايا النباتات المجهرية و / أو أنواع trichome الأخرى. يمكن تنفيذ هذه الخطوة باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة 8,10 أو المناخل بأحجام مختلفة 7,9. نظرا للحساسية الشديدة للحمض النووي الريبي في الأنسجة المصنعة للعوامل المهينة ، عادة ما يتم إجراء هاتين الخطوتين المتتابعتين في وسط عزل الجليد البارد ، غالبا في وجود مثبطات البروتين4.
تتطلب بروتوكولات عزل trichome التقليدية ، بالإضافة إلى درجات الحرارة الباردة الجليدية ، كميات كبيرة من وسط العزل لضمان إجراء استخراج فعال. ينتج عن الجمع بين هذه المكونات عملية عزل شاقة وتستغرق وقتا طويلا وتعيق الإنتاجية العالية. لذلك ، من المحتمل أن يكون تقديم بروتوكول عزل ثلاثي الرؤوس بديل مباشر وسهل الاستخدام مفيدا لمختلف الجوانب المرتبطة بتوصيف trichome. تهدف هذه الورقة إلى تقديم بروتوكول بديل لعزل trichomes المسكرة والغدد اللاطئة من القنب ساتيفا من خلال الجمع بين عدة عناصر من البروتوكولات التقليدية ودمجها. تشمل هذه العناصر الثلج الجاف5 ، ومرور trichomes عبر العديد من المناخل الدقيقة ذات أحجام المسام المتناقصة 7,9 ، واستبدال النيتروجين السائل (LN) بوسط العزل8.
إن حداثة بروتوكول عزل trichome الحالي ، مقارنة بالبروتوكولات التقليدية ، تقدم بعدة طرق. هذا البروتوكول مناسب ، لأنه لا يتطلب مكونات خطرة. يمكن إجراء العملية في المختبر بأقل قدر من الاحتياطات وتسهل الإنتاجية العالية. يضمن استبدال LN بوسط عزل السائل القياسي سلامة trichomes طوال عملية العزل ، مما يتيح التحليل النسخي اللاحق. عند تسامي LN والثلج الجاف ، تترك trichomes المعزولة خالية من المخلفات الضارة. علاوة على ذلك ، فإن ميل LN إلى التسامي في درجة حرارة الغرفة يسمح باستخدامه السخي في جميع أنحاء البروتوكول. في المقابل ، فإن استخدام كميات كبيرة من وسيط العزل التقليدي يولد صعوبات عملية في التعامل معها. أخيرا ، يقلل البروتوكول من فصل خلية القرص عن بنية الرأس الهشة المتبقية للثلاثي الغدي ، مما يتيح الاحتفاظ بمحتوى مساحة الرأس.
يتم تقديم هذا البروتوكول بطريقة مفصلة خطوة بخطوة مصممة للمساعدة في الممارسة الفنية لعزل C. sativa غدية trichomes. يوفر البروتوكول سير عمل يمكن التحكم فيه ينتج عنه ترايكهومات معزولة ذات تركيز عال ونقاء مناسبين للتحليل الجزيئي النهائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقارنة ببروتوكولات عزل trichome المتاحة حاليا ، تم وصف تعديلين رئيسيين في البروتوكول الحالي. وتشمل هذه انفصال trichomes عن المواد النباتية باستخدام الثلج الجاف في الخطوة الأولية واستبدال LN للوسط العازل السائل شائع الاستخدام. يعتمد التعديل الأول لتنقية C. sativa trichome على بروتوكول سابق أدخل استخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بالدعم المالي من CannabiVar Ltd. تم توفير جميع المواد النباتية بسخاء من قبل البروفيسور هينانيت كولتاي من مركز البراكين ، إسرائيل.
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
