Ikke-vandig isolering og berigelse af kirtelkapiteller stilkede og sessile trichomer fra Cannabis sativa

Summary

En protokol præsenteres for bekvem og høj gennemstrømning isolering og berigelse af kirtelcapitate stilkede og sessile trichomer fra Cannabis sativa. Protokollen er baseret på en tør, ikke-bufferekstraktion af trichomer ved kun at bruge flydende nitrogen, tøris og nylonsigter og er velegnet til RNA-ekstraktion og transkriptomisk analyse.

Abstract

Dette papir præsenterer en protokol for bekvem og høj gennemstrømning isolering og berigelse af kirtelcapitate stilkede og sessile trichomer fra Cannabis sativa. De biosyntetiske veje til cannabinoid og flygtig terpenmetabolisme er primært lokaliseret i cannabistrichomerne, og isolerede trichomer er gavnlige for transkriptomanalyse. De eksisterende protokoller til isolering af kirteltrichomer til transkriptomisk karakterisering er ubelejlige og leverer kompromitterede trichomehoveder og en relativt lav mængde isolerede trichomer. Desuden er de afhængige af dyre apparater og isolationsmedier, der indeholder proteinhæmmere for at undgå RNA-nedbrydning. Den nuværende protokol foreslår at kombinere tre individuelle modifikationer for at opnå en stor mængde isolerede kirtelcapitate stilkede og sessile trichomer fra henholdsvis C. sativa modne kvindelige blomsterstande og vifteblade. Den første modifikation indebærer at erstatte flydende nitrogen med det konventionelle isolationsmedium for at lette passagen af trichomer gennem mikrosigterne. Den anden ændring indebærer at bruge tøris til at løsne trichomerne fra plantekilden. Den tredje modifikation indebærer, at plantematerialet ledes fortløbende gennem fem mikrosigter med faldende porestørrelser. Mikroskopisk billeddannelse viste effektiviteten af isolationsteknikken for begge trichome-typer. Derudover var kvaliteten af RNA ekstraheret fra de isolerede trichomer passende til nedstrøms transkriptomisk analyse.

Introduction

Kirteltrichomer er hårlignende strukturer, der findes i planter, der indeholder mange sekundære metabolitter¹ og repræsenterer en værdifuld bank af nye biosyntetiske gener og enzymer². I cannabis er biosyntesen af de vigtige sekundære metabolitter, cannabinoider³ og terpener⁴, lokaliseret i trichomerne. I betragtning af trichomers rolle i bestemmelsen af kvaliteten af cannabis både til medicinske og rekreative anvendelser er undersøgelsen af trichome-genekspression af interesse. For at karakterisere ekspressionen af trichome-specifikke gener skal trichomerne af interesse først isoleres. Trichome-isolationsprotokoller blev først beskrevet allerede i 1992⁵, og deres seneste udvikling er for nylig blevet gennemgået². Generelt kan protokoller til ekstraktion af kirteltrichomer til transkriptomisk karakterisering opdeles i to forskellige sekventielle trin. Det første trin indebærer en grundig fysisk adskillelse af trichomerne fra plantevævet. Dette trin kan udføres ved hjælp af tøris⁵, glasperler med et kommercielt apparat^6,7, formaling af plantematerialet mod en maskesigte⁸ eller hvirvelstrøm af plantevævet i en isolationsbuffer⁹. Det andet trin indebærer en mere raffineret adskillelse af de relevante trichomer fra de mikroskopiske planterester og/eller andre trichometyper. Dette trin kan udføres ved hjælp af densitetsgradientcentrifugering ^8,10 eller sigter i forskellige størrelser ^7,9. På grund af RNA’s ekstreme følsomhed i forarbejdede væv over for nedbrydende midler udføres disse to sekventielle trin sædvanligvis i det iskolde isolationsmedium, ofte i nærvær af proteinhæmmere⁴.

Konventionelle trichome-isolationsprotokoller kræver, ud over de iskolde temperaturer, store mængder isolationsmedium for at sikre en effektiv ekstraktionsprocedure. Kombinationen af disse komponenter resulterer i en besværlig, tidskrævende isoleringsproces, der forhindrer høj gennemstrømning. Præsentation af en ligetil, brugervenlig alternativ trichome-isolationsprotokol vil derfor sandsynligvis være gavnlig for forskellige aspekter forbundet med trichome-karakterisering. Dette papir sigter mod at tilbyde en alternativ protokol til isolering af stilkede og siddende kirtelcapitate-trichomer fra Cannabis sativa ved at kombinere og integrere flere elementer fra de konventionelle protokoller. Disse elementer omfatter tøris⁵, passage af trichomerne gennem flere mikrosigter med faldende porestørrelser ^7,9 og erstatning af flydende nitrogen (LN) med isolationsmediet⁸.

Nyheden ved den nuværende trichome-isolationsprotokol sammenlignet med konventionelle protokoller præsenterer på en række måder. Denne protokol er praktisk, da den ikke kræver farlige komponenter. Proceduren kan udføres i laboratoriet med minimale forholdsregler og letter høj gennemstrømning. Erstatning af LN for standard væskeisoleringsmediet sikrer trichomernes integritet gennem hele isolationsprocessen, hvilket muliggør efterfølgende transkriptomisk analyse. Ved sublimering af LN og tøris efterlades de isolerede trichomer fri for skadelige rester. Endvidere tillader LN’s tilbøjelighed til at sublimere ved stuetemperatur dets generøse anvendelse i hele protokollen. I modsætning hertil skaber brugen af store mængder konventionelt isoleringsmedium praktiske vanskeligheder ved håndteringen. Endelig reducerer protokollen adskillelsen af diskcellen fra den resterende skrøbelige hovedstruktur i kirtellomen, hvilket muliggør bevarelse af headspace-indholdet.

Denne protokol præsenteres på en detaljeret trin-for-trin måde designet til at hjælpe den tekniske praksis med at isolere C. sativa glandular capitate trichomes. Protokollen giver en håndterbar arbejdsgang, der resulterer i isolerede trichomer med en høj koncentration og renhed, der er passende til nedstrøms molekylær analyse.

Protocol

BEMÆRK: Plantematerialet, der blev anvendt i denne undersøgelse, bestod af fire C. sativa ARO-Volcani-stammer (CS-11, CS-12, CS-13 og CS-14), der blev dyrket i Volcani Center, Israel, som beskrevet andetsteds11. Glandular capitate stalkede trichomer blev isoleret fra modne blomstrende blomsterstande, og kirtelcapitate sessile trichomes blev isoleret fra store vifteblade fra modne ikke-blomstrende moderplanter. Alt plantemateriale blev friskplukket og straks opbevaret ved -80 °C. <p…

Representative Results

Den vigtigste ændring inkluderet i denne protokol sammenlignet med konventionelle trichome-isolationsprotokoller er at erstatte standardisolationsmediet med LN. Brug af LN som isolationsmedium tillader en afslappet arbejdsgang, fordi så længe prøverne er nedsænket i LN, er metabolisk nedbrydning sandsynligvis ikke forekommende. Da protokollen desuden undgår de farlige komponenter (dvs. aurintricarboxylsyre og β-mercaptoethanol), der anvendes i traditionelt trichome-isolationsmedium, er arbejdet ikke begrænset til…

Discussion

Sammenlignet med de aktuelt tilgængelige trichome-isolationsprotokoller er to hovedændringer beskrevet i denne protokol. Disse omfatter frigørelse af trichomerne fra plantematerialet ved hjælp af tøris i det indledende trin og erstatning af LN for det almindeligt anvendte flydende buffermedium. Den første ændring for C. sativa trichome rensning er baseret på en tidligere protokol, der introducerede brugen af knust tøris til at løsne trichomerne fra geranium pedicels⁵. Mens tradi…

Materials

Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip	Agilent, Germany	Reorder number 5067-1513	Lab-on-a-chip system
Transsonic-310	Elma, Germany	D-78224	Ultrasonic cleaning unit
TruSeq RNA Sample Prep Kit v2	Illumina, USA	RS-122-2001	Sample preperation for RNA sequencing library
Spectrum Plant Total RNA Kit	SIGMA-ALDRICH, USA	STRN50-1KT	Plant Total RNA Kit
Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter)	Sinun Tech, Israel	r0350n350210	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0150n360465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0105n320718	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0065n340715	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen)
Suitable gloves for handling low temperatures
Safety goggles
1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm)
Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm
1 L glass beaker
1 block of dry ice (0.5-1 kg)
Hammer and hard flat object
Two 5 L plastic containers
Rubber bands
Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference
Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container
Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula
Clean plate
Several clothespins
Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle
Two containers of liquid nitrogen
1 cm wide painting brush