Niet-waterige isolatie en verrijking van glandulaire capitate gestalkte en sessiele trichomen van Cannabis sativa
Summary
Er wordt een protocol gepresenteerd voor de handige en high-throughput isolatie en verrijking van glandulaire capitate stalked en sessiele trichomen van Cannabis sativa. Het protocol is gebaseerd op een droge, niet-bufferextractie van trichomen met alleen vloeibare stikstof, droogijs en nylonzeven en is geschikt voor RNA-extractie en transcriptomische analyse.
Abstract
Dit artikel presenteert een protocol voor de handige en high-throughput isolatie en verrijking van glandulaire capitate stalked en sessiele trichomen van Cannabis sativa. De biosynthetische routes voor cannabinoïde en vluchtig terpeenmetabolisme zijn voornamelijk gelokaliseerd in de Cannabis trichomen, en geïsoleerde trichomen zijn gunstig voor transcriptoomanalyse. De bestaande protocollen voor het isoleren van glandulaire trichomen voor transcriptomische karakterisering zijn onhandig en leveren gecompromitteerde trichoomkoppen en een relatief lage hoeveelheid geïsoleerde trichomen. Bovendien vertrouwen ze op dure apparaten en isolatiemedia die eiwitremmers bevatten om RNA-afbraak te voorkomen. Het huidige protocol stelt voor om drie individuele modificaties te combineren om een grote hoeveelheid geïsoleerde glandulaire capitate stalked en sessiele trichomen te verkrijgen van respectievelijk C. sativa volwassen vrouwelijke bloeiwijzen en waaierbladeren. De eerste wijziging omvat het vervangen van vloeibare stikstof door het conventionele isolatiemedium om de doorgang van trichomen door de microzeven te vergemakkelijken. De tweede wijziging omvat het gebruik van droogijs om de trichomen los te maken van de plantenbron. De derde modificatie houdt in dat het plantmateriaal achtereenvolgens door vijf microzeven van afnemende poriegroottes wordt geleid. Microscopische beeldvorming toonde de effectiviteit van de isolatietechniek voor beide trichoomtypen. Bovendien was de kwaliteit van RNA geëxtraheerd uit de geïsoleerde trichomen geschikt voor downstream transcriptomische analyse.
Introduction
Glandulaire trichomen zijn haarachtige structuren die aanwezig zijn in planten die veel secundaire metabolietenbevatten 1 en een waardevolle bank van nieuwe biosynthetische genen en enzymen2 vertegenwoordigen. In cannabis is de biosynthese van de belangrijke secundaire metabolieten, cannabinoïden3 en terpenen4, gelokaliseerd in de trichomen. Gezien de rol van trichomen bij het bepalen van de kwaliteit van cannabis, zowel voor medicinaal als recreatief gebruik, is de studie van trichomengenexpressie van belang. Om de expressie van trichomenspecifieke genen te karakteriseren, moeten de trichomen van belang eerst worden geïsoleerd. Trichoomisolatieprotocollen werden voor het eerst beschreven in 19925, en hun nieuwste ontwikkelingen zijn onlangs beoordeeld2. Over het algemeen kunnen protocollen voor het extraheren van glandulaire trichomen voor transcriptomische karakterisering worden onderverdeeld in twee verschillende opeenvolgende stappen. De eerste stap omvat een grondige fysieke scheiding van de trichomen van het plantenweefsel. Deze stap kan worden uitgevoerd met droogijs5, glasparels met een commercieel apparaat6,7, het vermalen van het plantmateriaal tegen een gaaszeef8, of het vortexen van het plantenweefsel in een isolatiebuffer9. De tweede stap omvat een meer verfijnde scheiding van de trichomen van belang van de microscopische plantenresten en / of andere trichoomsoorten. Deze stap kan worden uitgevoerd met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie 8,10 of zeven van verschillende groottes 7,9. Vanwege de extreme gevoeligheid van RNA in bewerkte weefsels voor afbrekende middelen, worden deze twee opeenvolgende stappen meestal uitgevoerd in het ijskoude isolatiemedium, vaak in aanwezigheid van eiwitremmers4.
Conventionele trichoomisolatieprotocollen vereisen, naast de ijskoude temperaturen, grote hoeveelheden isolatiemedium om een efficiënte extractieprocedure te garanderen. De combinatie van deze componenten resulteert in een moeizaam, tijdrovend isolatieproces dat een hoge doorvoer belemmert. Het presenteren van een eenvoudig, gebruiksvriendelijk alternatief trichome-isolatieprotocol is daarom waarschijnlijk gunstig voor verschillende aspecten die verband houden met trichoomkarakterisering. Het huidige artikel heeft tot doel een alternatief protocol aan te bieden voor het isoleren van gestalkte en sessiele glandulaire capitate trichomen van Cannabis sativa door verschillende elementen uit de conventionele protocollen te combineren en te integreren. Deze elementen omvatten droogijs5, het passeren van de trichomen door verschillende microzeven met afnemende poriegroottes 7,9 en het vervangen van vloeibare stikstof (LN) voor het isolatiemedium8.
De nieuwigheid van het huidige trichomenisolatieprotocol, in vergelijking met conventionele protocollen, presenteert zich op een aantal manieren. Dit protocol is handig, omdat het geen gevaarlijke componenten vereist. De procedure kan in het laboratorium worden uitgevoerd met minimale voorzorgsmaatregelen en vergemakkelijkt een hoge doorvoer. Het vervangen van LN door het standaard vloeibare isolatiemedium zorgt voor de integriteit van de trichomen gedurende het hele isolatieproces, waardoor daaropvolgende transcriptomische analyse mogelijk is. Bij sublimatie van de LN en droogijs blijven de geïsoleerde trichomen vrij van schadelijke resten. Verder maakt de neiging van LN om te sublimeren bij kamertemperatuur het royale gebruik ervan in het hele protocol mogelijk. Het gebruik van grote hoeveelheden conventioneel isolatiemedium levert daarentegen praktische problemen op bij de hantering ervan. Ten slotte vermindert het protocol de scheiding van de schijfcel van de resterende fragiele hoofdstructuur van het glandulaire trichome, waardoor de inhoud van de hoofdruimte behouden blijft.
Dit protocol wordt gepresenteerd op een gedetailleerde stap-voor-stap manier ontworpen om de technische praktijk van het isoleren van C. sativa glandulaire capitate trichomen te ondersteunen. Het protocol biedt een beheersbare workflow die resulteert in geïsoleerde trichomen met een hoge concentratie en zuiverheid die geschikt zijn voor downstream moleculaire analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ten opzichte van de momenteel beschikbare trichomenisolatieprotocollen worden in dit protocol twee belangrijke wijzigingen beschreven. Deze omvatten het losmaken van de trichomen van het plantmateriaal met behulp van droogijs in de eerste stap en het vervangen van LN door het veelgebruikte vloeibare buffermedium. De eerste modificatie voor C. sativa trichomenzuivering is gebaseerd op een eerder protocol dat het gebruik van gemalen droogijs introduceerde om de trichomen los te maken van geraniumpedicels<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de financiële steun van CannabiVar Ltd. Al het plantmateriaal werd genereus verstrekt door professor Hinanit Koltai van het Volcani Center, Israël.
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
