Isolement non aqueux et enrichissement des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa
Summary
Un protocole est présenté pour l’isolement et l’enrichissement pratiques et à haut débit des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa. Le protocole est basé sur une extraction sèche et non tampon des trichomes en utilisant uniquement de l’azote liquide, de la glace sèche et des tamis en nylon et convient à l’extraction d’ARN et à l’analyse transcriptomique.
Abstract
Cet article présente un protocole pour l’isolement et l’enrichissement pratiques et à haut débit des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa. Les voies de biosynthèse pour le métabolisme des cannabinoïdes et des terpènes volatils sont localisées principalement dans les trichomes de cannabis , et les trichomes isolés sont bénéfiques pour l’analyse du transcriptome. Les protocoles existants pour isoler les trichomes glandulaires pour la caractérisation transcriptomique sont peu pratiques et fournissent des têtes de trichomes compromises et une quantité relativement faible de trichomes isolés. De plus, ils s’appuient sur des appareils coûteux et des milieux d’isolement contenant des inhibiteurs de protéines pour éviter la dégradation de l’ARN. Le protocole actuel suggère de combiner trois modifications individuelles pour obtenir une grande quantité de trichomes glandulaires et de trichomes sessiles isolés à partir d’inflorescences femelles matures et de feuilles en éventail, respectivement. La première modification consiste à substituer l’azote liquide au milieu isolant conventionnel pour faciliter le passage des trichomes à travers les micro-tamis. La deuxième modification consiste à utiliser de la glace sèche pour détacher les trichomes de la source végétale. La troisième modification consiste à faire passer le matériel végétal consécutivement à travers cinq micro-tamis de taille décroissante des pores. L’imagerie microscopique a démontré l’efficacité de la technique d’isolement pour les deux types de trichomes. De plus, la qualité de l’ARN extrait des trichomes isolés était appropriée pour l’analyse transcriptomique en aval.
Introduction
Les trichomes glandulaires sont des structures ressemblant à des cheveux présentes dans les plantes qui contiennent de nombreux métabolites secondaires1 et représentent une banque précieuse de nouveaux gènes et enzymes biosynthétiques2. Dans le cannabis, la biosynthèse des métabolites secondaires importants, cannabinoïdes3 et terpènes4, est localisée dans les trichomes. Compte tenu du rôle des trichomes dans la détermination de la qualité du cannabis à des fins médicinales et récréatives, l’étude de l’expression des gènes des trichomes est intéressante. Pour caractériser l’expression des gènes spécifiques aux trichomes, les trichomes d’intérêt doivent d’abord être isolés. Les protocoles d’isolement des trichomes ont été décrits pour la première fois dès 19925, et leurs derniers développements ont été récemment examinés2. En général, les protocoles d’extraction des trichomes glandulaires pour la caractérisation transcriptomique peuvent être divisés en deux étapes séquentielles distinctes. La première étape implique une séparation physique complète des trichomes du tissu végétal. Cette étape peut être réalisée en utilisant de la glace sèche5, des billes de verre avec un appareil commercial6,7, en broyant le matériel végétal contre un tamis à mailles8, ou en tourbillonnant le tissu végétal dans un tampon d’isolement9. La deuxième étape consiste à séparer plus finement les trichomes d’intérêt des résidus de plantes microscopiques et/ou d’autres types de trichomes. Cette étape peut être exécutée en utilisant la centrifugation à gradient de densité 8,10 ou des tamis de différentes tailles 7,9. En raison de l’extrême sensibilité de l’ARN dans les tissus traités aux agents dégradants, ces deux étapes séquentielles sont généralement conduites dans le milieu d’isolement glacé, souvent en présence d’inhibiteurs de protéines4.
Les protocoles conventionnels d’isolement des trichomes nécessitent, en plus des températures glaciales, de grandes quantités de milieu d’isolement pour assurer une procédure d’extraction efficace. La combinaison de ces composants entraîne un processus d’isolation long et fastidieux qui entrave un débit élevé. La présentation d’un protocole alternatif simple et convivial d’isolement des trichomes est donc susceptible d’être bénéfique pour divers aspects associés à la caractérisation des trichomes. Le présent article vise à offrir un protocole alternatif pour isoler les trichomes de tête glandulaires pédonculés et sessiles de Cannabis sativa en combinant et en intégrant plusieurs éléments des protocoles conventionnels. Ces éléments comprennent la glace carbonique5, le passage des trichomes à travers plusieurs micro-tamis avec des pores de taille décroissante7,9, et la substitution de l’azote liquide (LN) au milieu isolant8.
La nouveauté du protocole actuel d’isolement des trichomes, par rapport aux protocoles conventionnels, se présente de plusieurs façons. Ce protocole est pratique, car il ne nécessite pas de composants dangereux. La procédure peut être effectuée en laboratoire avec un minimum de précautions et facilite un débit élevé. La substitution du LN au milieu d’isolation liquide standard garantit l’intégrité des trichomes tout au long du processus d’isolement, ce qui permet une analyse transcriptomique ultérieure. Lors de la sublimation du LN et de la glace sèche, les trichomes isolés sont laissés exempts de résidus nocifs. De plus, la propension du LN à se sublimer à température ambiante permet son utilisation généreuse tout au long du protocole. En revanche, l’utilisation de grands volumes de milieu isolant conventionnel génère des difficultés pratiques dans sa manipulation. Enfin, le protocole diminue la séparation de la cellule discale de la structure de tête fragile restante du trichome glandulaire, permettant la rétention du contenu de l’espace de tête.
Ce protocole est présenté étape par étape détaillée pour faciliter la pratique technique d’isolement des trichomes à tête glandulaire de C. sativa. Le protocole fournit un flux de travail gérable qui se traduit par des trichomes isolés avec une concentration et une pureté élevées qui sont appropriés pour l’analyse moléculaire en aval.
Protocol
Representative Results
Discussion
Par rapport aux protocoles d’isolement des trichomes actuellement disponibles, deux modifications principales sont décrites dans le présent protocole. Il s’agit notamment du détachement des trichomes du matériel végétal à l’aide de glace sèche à l’étape initiale et de la substitution du LN au milieu tampon liquide couramment utilisé. La première modification pour la purification des trichomes de C. sativa est basée sur un protocole antérieur qui a introduit l’utilisation de glace sèche p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le soutien financier de CannabiVar Ltd. Tout le matériel végétal a été généreusement fourni par le professeur Hinanit Koltai du Volcani Center, en Israël.
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
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