कैनबिस सैटिवा से ग्लैंडुलर कैपिटे स्टाक्ड और सेसिल ट्राइकोम्स का गैर-जलीय अलगाव और संवर्धन
Summary
कैनबिस सैटिवा से ग्रंथियों के फैलाव और सेसिल ट्राइकोम के सुविधाजनक और उच्च-थ्रूपुट अलगाव और संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल केवल तरल नाइट्रोजन, सूखी बर्फ और नायलॉन छलनी का उपयोग करके ट्राइकोम के सूखे, गैर-बफर निष्कर्षण पर आधारित है और आरएनए निष्कर्षण और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है।
Abstract
यह पेपर कैनबिस सैटिवा से ग्रंथियों के प्रतिपादक पीछा और सेसिल ट्राइकोम के सुविधाजनक और उच्च-थ्रूपुट अलगाव और संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। कैनबिनोइड और वाष्पशील टेरपेन चयापचय के लिए बायोसिंथेटिक मार्ग मुख्य रूप से कैनबिस ट्राइकोम में स्थानीयकृत होते हैं, और पृथक ट्राइकोम ट्रांसस्क्रिप्टम विश्लेषण के लिए फायदेमंद होते हैं। ट्रांसक्रिप्टोमिक लक्षण वर्णन के लिए ग्रंथियों के ट्राइकोम को अलग करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल असुविधाजनक हैं और समझौता ट्राइकोम हेड और अपेक्षाकृत कम मात्रा में पृथक ट्राइकोम प्रदान करते हैं। इसके अलावा, वे आरएनए क्षरण से बचने के लिए प्रोटीन अवरोधकों वाले महंगे उपकरण और अलगाव मीडिया पर भरोसा करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में क्रमशः सी. सैटिवा परिपक्व महिला पुष्पक्रम और पंखे की पत्तियों से बड़ी मात्रा में पृथक ग्रंथियों के कैपिटा स्टॉक्ड और सेसिल ट्राइकोम प्राप्त करने के लिए तीन अलग-अलग संशोधनों को संयोजित करने का सुझाव दिया गया है। पहले संशोधन में सूक्ष्म-छलनी के माध्यम से ट्राइकोम के पारित होने की सुविधा के लिए पारंपरिक अलगाव माध्यम के लिए तरल नाइट्रोजन को प्रतिस्थापित करना शामिल है। दूसरे संशोधन में पौधे के स्रोत से ट्राइकोम को अलग करने के लिए सूखी बर्फ का उपयोग करना शामिल है। तीसरे संशोधन में पौधे की सामग्री को लगातार घटते छिद्र आकार के पांच सूक्ष्म-छलनी के माध्यम से पारित करना शामिल है। माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग ने दोनों ट्राइकोम प्रकारों के लिए अलगाव तकनीक की प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, पृथक ट्राइकोम से निकाले गए आरएनए की गुणवत्ता डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त थी।
Introduction
ग्लैंडुलर ट्राइकोम पौधों में मौजूद बाल जैसी संरचनाएं हैं जिनमें कई माध्यमिक मेटाबोलाइट्सहोते हैं 1 और नए बायोसिंथेटिक जीन और एंजाइम2 के एक मूल्यवान बैंक का प्रतिनिधित्व करते हैं। कैनबिस में, महत्वपूर्ण माध्यमिक मेटाबोलाइट्स, कैनबिनोइड्स3 और टेरपेन4 का जैवसंश्लेषण ट्राइकोम में स्थानीयकृत है। औषधीय और मनोरंजक उपयोगों के लिए कैनबिस की गुणवत्ता निर्धारित करने में ट्राइकोम की भूमिका को ध्यान में रखते हुए, ट्राइकोम जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन रुचि का है। ट्राइकोम-विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति को चिह्नित करने के लिए, रुचि के ट्राइकोम को पहले अलग किया जाना चाहिए। ट्राइकोम अलगाव प्रोटोकॉल को पहली बार 19925 की शुरुआत में वर्णित किया गया था, और उनके नवीनतमविकास की हाल ही में समीक्षा की गई है। सामान्य तौर पर, ट्रांसक्रिप्टोमिक लक्षण वर्णन के लिए ग्रंथियों के ट्राइकोम निकालने के प्रोटोकॉल को दो अलग-अलग अनुक्रमिक चरणों में विभाजित किया जा सकता है। पहले चरण में पौधे के ऊतकों से ट्राइकोम का पूरी तरह से भौतिक पृथक्करण शामिल है। यह चरण सूखी बर्फ5, वाणिज्यिक उपकरण 6,7 के साथ कांच के मोतियों का उपयोग करके, जाल छलनी8 के खिलाफ पौधे की सामग्री को पीसकर, या एक अलगाव बफर9 में पौधे के ऊतकों को भंवर करके किया जा सकता है। दूसरे चरण में सूक्ष्म पौधों के अवशेषों और / या अन्य ट्राइकोम प्रकारों से रुचि के ट्राइकोम का अधिक परिष्कृत पृथक्करण शामिल है। इस चरण को घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन8,10 या विभिन्न आकारों 7,9 की छलनी का उपयोग करके निष्पादित किया जा सकता है। डिग्रेडिंग एजेंटों के लिए संसाधित ऊतकों में आरएनए की अत्यधिक संवेदनशीलता के कारण, ये दो अनुक्रमिक चरण आमतौर पर बर्फ-ठंडे अलगाव माध्यम में आयोजित किए जाते हैं, अक्सर प्रोटीनअवरोधकों की उपस्थिति में 4।
पारंपरिक ट्राइकोम अलगाव प्रोटोकॉल को बर्फ-ठंडे तापमान के अलावा, एक कुशल निष्कर्षण प्रक्रिया सुनिश्चित करने के लिए बड़ी मात्रा में अलगाव माध्यम की आवश्यकता होती है। इन घटकों के संयोजन के परिणामस्वरूप एक कठिन, समय लेने वाली अलगाव प्रक्रिया होती है जो उच्च थ्रूपुट में बाधा डालती है। इसलिए, एक सीधा, उपयोगकर्ता के अनुकूल वैकल्पिक ट्राइकोम अलगाव प्रोटोकॉल प्रस्तुत करना ट्राइकोम लक्षण वर्णन से जुड़े विभिन्न पहलुओं के लिए फायदेमंद होने की संभावना है। वर्तमान पेपर का उद्देश्य पारंपरिक प्रोटोकॉल से कई तत्वों को जोड़कर और एकीकृत करके कैनबिस सैटिवा से स्टॉक्ड और सेसिले ग्लैंडुलर कैपिटेट ट्राइकोम को अलग करने के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। इन तत्वों में शुष्क बर्फ5, घटते छिद्र आकार 7,9 के साथ कई सूक्ष्म-छलनी के माध्यम से ट्राइकोमका गुजरना और अलगाव माध्यम8 के लिए तरल नाइट्रोजन (एलएन) को प्रतिस्थापित करना शामिल है।
पारंपरिक प्रोटोकॉल की तुलना में वर्तमान ट्राइकोम अलगाव प्रोटोकॉल की नवीनता, कई तरीकों से प्रस्तुत होती है। यह प्रोटोकॉल सुविधाजनक है, क्योंकि इसके लिए खतरनाक घटकों की आवश्यकता नहीं है। प्रक्रिया को प्रयोगशाला में न्यूनतम सावधानी के साथ आयोजित किया जा सकता है और उच्च थ्रूपुट की सुविधा प्रदान करता है। मानक तरल अलगाव माध्यम के लिए एलएन को प्रतिस्थापित करना अलगाव प्रक्रिया के दौरान ट्राइकोम की अखंडता सुनिश्चित करता है, जिससे बाद में ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण सक्षम होता है। एलएन और सूखी बर्फ के उच्चीकरण पर, पृथक ट्राइकोम को हानिकारक अवशिष्ट से मुक्त छोड़ दिया जाता है। इसके अलावा, कमरे के तापमान पर एलएन की प्रवृत्ति पूरे प्रोटोकॉल में इसके उदार उपयोग की अनुमति देती है। इसके विपरीत, पारंपरिक अलगाव माध्यम की बड़ी मात्रा का उपयोग करने से इसकी हैंडलिंग में व्यावहारिक कठिनाइयां उत्पन्न होती हैं। अंत में, प्रोटोकॉल ग्रंथियों के ट्राइकोम की शेष नाजुक सिर संरचना से डिस्क सेल के पृथक्करण को कम करता है, जिससे हेडस्पेस सामग्री का प्रतिधारण सक्षम होता है।
इस प्रोटोकॉल को एक विस्तृत चरण-दर-चरण फैशन में प्रस्तुत किया गया है जो सी सैटिवा ग्लैंडुलर कैपिटेट ट्राइकोम्स को अलग करने के तकनीकी अभ्यास की सहायता के लिए डिज़ाइन किया गया है। प्रोटोकॉल एक प्रबंधनीय वर्कफ़्लो प्रदान करता है जिसके परिणामस्वरूप उच्च एकाग्रता और शुद्धता के साथ पृथक ट्राइकोम होते हैं जो डाउनस्ट्रीम आणविक विश्लेषण के लिए उपयुक्त होते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान में उपलब्ध ट्राइकोम अलगाव प्रोटोकॉल की तुलना में, वर्तमान प्रोटोकॉल में दो मुख्य संशोधनों का वर्णन किया गया है। इनमें प्रारंभिक चरण में सूखी बर्फ का उपयोग करके पौधे की सामग्री से ट्राइकोम की ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक कैनबीवर लिमिटेड से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं। सभी पौधों की सामग्री उदारतापूर्वक वोल्कानी सेंटर, इज़राइल से प्रोफेसर हिनानिट कोलताई द्वारा प्रदान की गई थी।
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
