カンナビスサティバからの腺頭状茎および固着毛状突起の非水性分離と濃縮
Summary
カンナビスサティバからの腺頭状茎および固着毛状突起の便利で高スループットの分離と濃縮のためのプロトコルが提示されています。このプロトコルは、液体窒素、ドライアイス、ナイロンふるいのみを使用したトリコームの乾燥した非緩衝抽出に基づいており、RNA抽出およびトランスクリプトーム解析に適しています。
Abstract
この論文は、 カンナビスサティバからの腺頭状茎および固着性毛状突起の便利でハイスループットな分離と濃縮のためのプロトコルを提示します。カンナビノイドと揮発性テルペン代謝の生合成経路は主に 大麻 トリコームに局在しており、単離されたトリコームはトランスクリプトーム分析に有益です。トランスクリプトームの特性評価のために腺毛状突起を単離するための既存のプロトコルは不便であり、毛状突起ヘッドが損なわれ、孤立した毛状突起が比較的少量になります。さらに、RNA分解を避けるために、タンパク質阻害剤を含む高価な装置と分離媒体に依存しています。本プロトコルは、3つの個別の修飾を組み合わせて、 それぞれC. sativa 成熟雌花序および扇形葉から大量の単離された腺頭状茎および固着毛状突起を得ることを示唆している。第1の改変は、マイクロシーブを通るトリコームの通過を容易にするために、従来の単離媒体を液体窒素に置き換えることを含む。2番目の変更では、ドライアイスを使用してトリコームを植物源から切り離します。第3の変更は、細孔サイズが減少する5つのマイクロシーブに植物材料を連続して通過させることを含む。顕微鏡イメージングは、両方のトリコームタイプに対する分離技術の有効性を示しました。さらに、単離されたトリコームから抽出されたRNAの品質は、下流のトランスクリプトーム解析に適切でした。
Introduction
腺毛状突起は、多くの二次代謝産物1を含む植物に存在する毛のような構造であり、新しい生合成遺伝子と酵素の貴重なバンクを表しています2。大麻では、重要な二次代謝産物であるカンナビノイド3とテルペン4の生合成が毛状突起に局在しています。薬用と娯楽用の両方で大麻の品質を決定する上での毛状突起の役割を考慮すると、毛状突起遺伝子発現の研究は興味深いものです。トリコーム特異的遺伝子の発現を特徴付けるには、まず目的のトリコームを単離する必要があります。トリコーム分離プロトコルは、早くも1992年に最初に記述されました5、そしてそれらの最新の開発は最近レビューされました2。一般に、トランスクリプトミクス特性評価のために腺トリコームを抽出するためのプロトコルは、2つの異なる連続ステップに分けることができます。最初のステップは、植物組織からの毛状突起の徹底的な物理的分離を含む。この工程は、ドライアイス5、ガラスビーズを市販の装置6,7を用いて、メッシュ篩8に対して植物材料を粉砕するか、または単離緩衝液9中で植物組織をボルテックスすることによって行うことができる。2番目のステップでは、関心のあるトリコームを微視的な植物残渣および/または他のトリコームタイプからより洗練された分離します。このステップは、密度勾配遠心分離8、10または様々なサイズの篩7、9を用いて実行することができる。処理された組織中のRNAは分解剤に対して極端に敏感であるため、これらの2つの連続したステップは通常、氷冷分離媒体中で、多くの場合タンパク質阻害剤の存在下で行われます4。
従来のトリコーム分離プロトコルでは、氷冷温度に加えて、効率的な抽出手順を確保するために大量の分離媒体が必要です。これらのコンポーネントの組み合わせにより、高スループットを妨げる、困難で時間のかかる絶縁プロセスが発生します。したがって、簡単でユーザーフレンドリーな代替のトリコーム分離プロトコルを提示することは、トリコームの特性評価に関連するさまざまな側面にとって有益である可能性があります。本論文は、従来のプロトコルのいくつかの要素を組み合わせて統合することにより、大麻サティバから茎および固着腺頭状毛状突起を分離するための代替プロトコルを提供することを目的としています。これらの要素には、ドライアイス5、細孔径7,9の減少を伴ういくつかのマイクロシーブを通るトリコームの通過、および隔離媒体8の液体窒素(LN)の置換が含まれます。
本トリコーム分離プロトコルの新規性は、従来のプロトコルと比較して、多くの点で提示される。このプロトコルは、危険なコンポーネントを必要としないため便利です。この手順は、最小限の予防措置でラボで実施でき、高スループットを促進します。標準的な液体分離媒体の代わりにLNを使用することで、単離プロセス全体を通してトリコームの完全性が保証され、その後のトランスクリプトーム解析が可能になります。LNとドライアイスが昇華すると、孤立したトリコームには有害な残留物がなくなります。さらに、LNは室温で昇華する傾向があるため、プロトコル全体で寛大な使用が可能になります。対照的に、従来の単離媒体を大量に使用すると、その取り扱いに実際的な困難が生じます。最後に、このプロトコルは、腺毛状突起の残りの壊れやすい頭部構造からの椎間板細胞の分離を減少させ、ヘッドスペースコンテンツの保持を可能にする。
このプロトコルは、 C. sativa glandular capitate trichomesを単離する技術的実践を支援するように設計された詳細なステップバイステップの方法で提示されます。このプロトコルは、下流の分子分析に適した高濃度および高純度の単離されたトリコームをもたらす管理可能なワークフローを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在利用可能なトリコーム単離プロトコルと比較して、2つの主要な変更が本プロトコルに記載されている。これらには、最初のステップでドライアイスを使用して植物材料からトリコームを剥離し、一般的に使用される液体緩衝媒体をLNに置き換えることが含まれます。 C. sativa trichome精製の最初の変更は、ゼラニウムペディセルからトリコームを分離するために砕いたドライアイスの…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、CannabiVar Ltd.からの財政的支援を認めている。すべての植物材料は、イスラエルのボルカニセンターのヒナニットコルタイ教授によって寛大に提供されました。
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
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