대마초 sativa에서 Glandular Capitate 스토킹 및 고착 Trichomes의 비 수성 분리 및 농축
Summary
Cannabis sativa의 선, capitate, 스토킹 및 고착성 trichomes의 편리하고 높은 처리량의 분리 및 농축을위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 액체 질소, 드라이 아이스 및 나일론 체만을 사용하는 트리초메의 건식, 비완충액 추출을 기반으로 하며 RNA 추출 및 전사체 분석에 적합합니다.
Abstract
이 논문은 Cannabis sativa에서 선, 항복, 스토킹 및 고착성 trichomes의 편리하고 처리량이 높은 분리 및 농축을 위한 프로토콜을 제시합니다. 칸나비노이드 및 휘발성 테르펜 대사를 위한 생합성 경로는 주로 대마 초 트리초메에 국한되어 있으며, 분리된 트리초메는 전사체 분석에 유용합니다. 전사체 특성화를 위해 선 모동을 분리하기 위한 기존 프로토콜은 불편하고 손상된 모합체 헤드와 상대적으로 적은 양의 분리된 모체를 제공합니다. 또한 RNA 분해를 방지하기 위해 단백질 억제제를 포함하는 고가의 장치 및 분리 배지에 의존합니다. 현재 프로토콜은 C. sativa 성숙한 암컷 꽃차례와 부채꼴 잎에서 각각 다량의 분리된 선상 항복 스토킹 및 고착성 트리초메를 얻기 위해 세 가지 개별 변형을 결합할 것을 제안합니다. 첫 번째 변형은 마이크로 체를 통한 트리코메의 통과를 용이하게 하기 위해 기존의 분리 매체를 액체 질소로 대체하는 것을 포함합니다. 두 번째 수정은 드라이 아이스를 사용하여 식물 공급원에서 trichomes를 분리하는 것입니다. 세 번째 변형은 기공 크기가 감소하는 5개의 미세 체를 통해 식물 재료를 연속적으로 통과시키는 것입니다. 현미경 이미징은 두 trichome 유형 모두에 대한 분리 기술의 효과를 입증했습니다. 또한, 분리된 트리초메로부터 추출된 RNA의 품질은 다운스트림 전사체 분석에 적합하였다.
Introduction
선모충(Glandular trichomes)은 식물에 존재하는 머리카락과 같은 구조로, 많은 2차 대사산물1을 함유하고 있으며, 새로운 생합성 유전자와 효소2의 귀중한 은행을대표한다. 대마초에서 중요한 2 차 대사 산물 인 칸 나비 노이드3 및 테르펜4의 생합성은 트리 코메에 국한되어 있습니다. 의약 및 레크리에이션 용도 모두에서 대마초의 품질을 결정하는 데 trichomes의 역할을 고려할 때, trichome 유전자 발현에 대한 연구가 중요합니다. trichome-specific 유전자의 발현을 특성화하기 위해, 관심있는 trichomes는 먼저 분리되어야한다. Trichome 격리 프로토콜은 1992 년 초에 처음 기술되었으며5, 최신 개발은 최근에 검토되었습니다2. 일반적으로, 전사체 특성화를 위해 선 모체를 추출하기 위한 프로토콜은 두 개의 별개의 순차적 단계로 나눌 수 있습니다. 첫 번째 단계는 식물 조직에서 trichomes를 완전히 물리적으로 분리하는 것입니다. 이 단계는 드라이 아이스 (5), 상업용 장치 (6, 7)를 갖는 유리 비드를 사용하거나, 메쉬 체 (8)에 대해 식물 재료를 분쇄하거나, 격리 완충액 (9)에서 식물 조직을 와동시킴으로써 수행 할 수있다. 두 번째 단계는 미세한 식물 잔류 물 및 / 또는 다른 trichome 유형에서 관심있는 trichomes를보다 정교하게 분리하는 것입니다. 이 단계는 밀도 구배 원심분리(8, 10) 또는 다양한 크기의 체(7, 9)를 사용하여 실행할 수 있다. 분해제에 대한 가공 조직의 RNA의 민감도가 매우 높기 때문에, 이 두 가지 순차적 단계는 일반적으로 단백질 억제제가 있는 상태에서 얼음처럼 차가운 격리 배지에서 수행된다4.
기존의 trichome 격리 프로토콜은 효율적인 추출 절차를 보장하기 위해 얼음처럼 차가운 온도 외에도 많은 양의 격리 매체가 필요합니다. 이러한 구성 요소의 조합은 높은 처리량을 방해하는 힘들고 시간이 많이 소요되는 격리 프로세스를 초래합니다. 따라서 간단하고 사용자 친화적인 대체 트리코메 분리 프로토콜을 제시하는 것은 트리코메 특성화와 관련된 다양한 측면에 도움이 될 수 있습니다. 본 논문은 기존 프로토콜의 여러 요소를 결합하고 통합하여 대마초 sativa에서 스토킹 및 고착성 선 capitate trichomes를 분리하기 위한 대체 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이러한 요소들은 드라이아이스(dry ice)5, 기공 크기가 감소하는 여러 개의 미세 체(micro-siev)를 통과하는 트리초메(trichomes)의 통과, 격리 매체(isolation medium)8를 액체 질소(LN)로 대체하는 것을 포함한다.
기존 프로토콜과 비교하여 현재 트리홈 격리 프로토콜의 참신함은 여러 가지 방식으로 나타납니다. 이 프로토콜은 위험한 구성 요소가 필요하지 않기 때문에 편리합니다. 이 절차는 최소한의 예방 조치로 실험실에서 수행 할 수 있으며 높은 처리량을 촉진합니다. 표준 액체 분리 배지를 LN으로 대체하면 분리 공정 전반에 걸쳐 트리코메의 무결성이 보장되어 후속 전사체 분석이 가능합니다. LN과 드라이 아이스가 승화되면 격리 된 트리 초메에는 유해한 잔류 물이 남지 않습니다. 또한, LN이 실온에서 승화하는 성향은 프로토콜 전반에 걸쳐 이의 관대한 사용을 가능하게 한다. 대조적으로, 대량의 종래의 격리 매체를 사용하는 것은 취급에 실질적인 어려움을 야기한다. 마지막으로, 프로토콜은 선 트리코메의 나머지 깨지기 쉬운 머리 구조에서 디스크 세포의 분리를 감소시켜 헤드스페이스 내용물의 유지를 가능하게 합니다.
이 프로토콜은 C. sativa glandular capitate trichomes를 분리하는 기술적 관행을 지원하도록 설계된 상세한 단계별 방식으로 제공됩니다. 이 프로토콜은 다운스트림 분자 분석에 적합한 고농도 및 순도의 분리된 트리코메를 생성하는 관리 가능한 워크플로우를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 이용가능한 트리코메 격리 프로토콜과 비교하여, 두 가지 주요 변형이 본 프로토콜에 기술되어 있다. 여기에는 초기 단계에서 드라이 아이스를 사용하여 식물 재료에서 trichomes를 분리하고 일반적으로 사용되는 액체 버퍼 매체를 LN으로 대체하는 것이 포함됩니다. C. sativa trichome 정제를 위한 첫 번째 변형은 제라늄 페디셀에서 트리초메를 분리하기 위해 으깬 드라이아이스를 사용하는 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 CannabiVar Ltd.의 재정 지원을 인정합니다. 모든 식물 재료는 이스라엘 화산 센터의 Hinanit Koltai 교수가 아낌없이 제공했습니다.
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
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