Isolamento Não Aquoso e Enriquecimento de Tricomas Glandulares e Tricomas Sésseis de Cannabis sativa
Summary
Um protocolo é apresentado para o isolamento e enriquecimento conveniente e de alto rendimento de tricomas glandulares e sésseis de Cannabis sativa. O protocolo é baseado em uma extração seca e não tampão de tricomas usando apenas nitrogênio líquido, gelo seco e peneiras de nylon e é adequado para extração de RNA e análise transcriptômica.
Abstract
Este trabalho apresenta um protocolo para o isolamento e enriquecimento conveniente e de alto rendimento de tricomas glandulares e sésseis de Cannabis sativa. As vias biossintéticas para o metabolismo de canabinóides e terpenos voláteis estão localizadas principalmente nos tricomas de Cannabis, e tricomas isolados são benéficos para a análise do transcriptoma. Os protocolos existentes de isolamento de tricomas glandulares para caracterização transcriptômica são inconvenientes e fornecem cabeças de tricomas comprometidas e uma quantidade relativamente baixa de tricomas isolados. Além disso, contam com aparelhos caros e meios de isolamento contendo inibidores de proteínas para evitar a degradação do RNA. O presente protocolo sugere a combinação de três modificações individuais para a obtenção de uma grande quantidade de tricomas glandulares e sésseis isolados de inflorescências femininas maduras e folhas leques de C. sativa , respectivamente. A primeira modificação envolve a substituição do nitrogênio líquido pelo meio de isolamento convencional para facilitar a passagem dos tricomas pelas micropeneiras. A segunda modificação envolve o uso de gelo seco para separar os tricomas da fonte vegetal. A terceira modificação envolve a passagem consecutiva do material vegetal através de cinco micropeneiras de poros decrescentes. Imagens microscópicas demonstraram a eficácia da técnica de isolamento para ambos os tipos de tricomas. Além disso, a qualidade do RNA extraído dos tricomas isolados foi adequada para análise transcriptômica a jusante.
Introduction
Tricomas glandulares são estruturas semelhantes a pelos presentes em plantas que contêm muitos metabólitos secundários1 e representam um valioso banco de novos genes biossintéticos e enzimas2. Na Cannabis, a biossíntese dos importantes metabólitos secundários, canabinóides3 e terpenos4, está localizada nos tricomas. Considerando o papel dos tricomas na determinação da qualidade da Cannabis tanto para uso medicinal quanto recreativo, o estudo da expressão gênica dos tricomas é de interesse. Para caracterizar a expressão de genes específicos de tricomas, os tricomas de interesse devem ser primeiramente isolados. Os protocolos de isolamento de tricomas foram descritos pela primeira vez em 19925, e seus desenvolvimentos mais recentes foram recentemente revisados2. Em geral, os protocolos de extração de tricomas glandulares para caracterização transcriptômica podem ser divididos em duas etapas sequenciais distintas. O primeiro passo envolve uma separação física completa dos tricomas do tecido vegetal. Essa etapa pode ser realizada utilizando-se gelo seco5, esferas de vidro com aparato comercial6,7, trituração do material vegetal contra uma peneira de malha 8 ou vórtex do tecido vegetal em tampãode isolamento9. A segunda etapa envolve uma separação mais refinada dos tricomas de interesse do resíduo vegetal microscópico e/ou outros tipos de tricomas. Esta etapa pode ser executada utilizando-se centrifugação por gradiente de densidade 8,10 ou peneiras de vários tamanhos 7,9. Devido à extrema sensibilidade do RNA nos tecidos processados aos agentes degradadores, essas duas etapas sequenciais são geralmente conduzidas no meio de isolamento gelado, muitas vezes na presença de inibidores proteicos4.
Os protocolos convencionais de isolamento de tricomas exigem, além das temperaturas geladas, grandes quantidades de meio de isolamento para garantir um procedimento de extração eficiente. A combinação desses componentes resulta em um processo de isolamento árduo e demorado que dificulta a alta taxa de transferência. A apresentação de um protocolo alternativo de isolamento de tricomas simples e fácil de usar é, portanto, provavelmente benéfica para vários aspectos associados à caracterização dos tricomas. O presente trabalho tem como objetivo oferecer um protocolo alternativo para o isolamento de tricomas capitatos glandulares caulinares e sésseis de Cannabis sativa, combinando e integrando vários elementos dos protocolos convencionais. Esses elementos incluem gelo seco5, passagem dos tricomas por várias micropeneiras com poros decrescentes 7,9 e substituição do nitrogênio líquido (NL) pelo meio de isolamento8.
A novidade do atual protocolo de isolamento de tricomas, em relação aos protocolos convencionais, apresenta-se de várias formas. Este protocolo é conveniente, pois não requer componentes perigosos. O procedimento pode ser realizado em laboratório com precauções mínimas e facilita o alto rendimento. A substituição do LN pelo meio de isolamento líquido padrão garante a integridade dos tricomas durante todo o processo de isolamento, permitindo a análise transcriptômica subsequente. Após a sublimação do NL e gelo seco, os tricomas isolados são deixados livres de resíduos nocivos. Além disso, a propensão do NL a sublimar à temperatura ambiente permite seu uso generoso durante todo o protocolo. Em contrapartida, a utilização de grandes volumes de meio isolante convencional gera dificuldades práticas no seu manuseio. Finalmente, o protocolo diminui a separação da célula discal da estrutura frágil remanescente da cabeça do tricoma glandular, permitindo a retenção do conteúdo do headspace.
Este protocolo é apresentado de forma detalhada e passo a passo, visando auxiliar a prática técnica de isolamento de tricomas capitatos glandulares de C. sativa. O protocolo fornece um fluxo de trabalho gerenciável que resulta em tricomas isolados com alta concentração e pureza que são apropriados para análise molecular a jusante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em comparação com os protocolos de isolamento de tricomas atualmente disponíveis, duas modificações principais são descritas no presente protocolo. Estes incluem o desprendimento dos tricomas do material vegetal usando gelo seco na etapa inicial e substituindo o LN pelo meio tampão líquido comumente usado. A primeira modificação para purificação de tricomas de C. sativa baseia-se em um protocolo anterior que introduziu o uso de gelo seco triturado para desprender os tricomas dos pedicelos de gerânio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o apoio financeiro da CannabiVar Ltd. Todo o material vegetal foi generosamente fornecido pelo professor Hinanit Koltai, do Centro Volcani, Israel.
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
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