Icke-vattenhaltig isolering och anrikning av glandular Capitate Stalkade och Sessile Trichomes från Cannabis sativa
Summary
Ett protokoll presenteras för bekväm och hög genomströmningsisolering och anrikning av glandular capitate stalkade och sessila trikomer från Cannabis sativa. Protokollet är baserat på en torr, icke-buffertextraktion av trikomer med endast flytande kväve, torris och nylonsiktar och är lämplig för RNA-extraktion och transkriptomisk analys.
Abstract
Detta dokument presenterar ett protokoll för bekväm och hög genomströmningsisolering och anrikning av glandulär kapitit stjälkad och sessil trikomer från Cannabis sativa. De biosyntetiska vägarna för cannabinoid och flyktig terpenmetabolism är lokaliserade främst i Cannabis trichomes, och isolerade trikomer är fördelaktiga för transkriptomanalys. De befintliga protokollen för isolering av glandulära trikomer för transkriptomisk karakterisering är obekväma och levererar komprometterade trikomhuvuden och en relativt låg mängd isolerade trikomer. Dessutom förlitar de sig på dyra apparater och isoleringsmedier som innehåller proteinhämmare för att undvika RNA-nedbrytning. Det nuvarande protokollet föreslår att man kombinerar tre individuella modifieringar för att erhålla en stor mängd isolerade glandulära kapitita stjälkade och sessila trikomer från C. sativa mogna kvinnliga blomställningar respektive fläktblad. Den första modifieringen innebär att det konventionella isoleringsmediet ersätts med flytande kväve för att underlätta passagen av trikomer genom mikrosiktarna. Den andra modifieringen innebär att man använder torris för att lossa trikomerna från växtkällan. Den tredje modifieringen innebär att växtmaterialet leds i följd genom fem mikrosiktar med minskande porstorlekar. Mikroskopisk avbildning visade effektiviteten av isoleringstekniken för båda trikomtyperna. Dessutom var kvaliteten på RNA extraherad från de isolerade trikomerna lämplig för transkriptomisk analys nedströms.
Introduction
Glandulära trikomer är hårliknande strukturer som finns i växter som innehåller många sekundära metaboliter1 och representerar en värdefull bank av nya biosyntetiska gener och enzymer2. I cannabis är biosyntesen av de viktiga sekundära metaboliterna, cannabinoider3 och terpener4, lokaliserad i trikomerna. Med tanke på trikomernas roll för att bestämma kvaliteten på cannabis både för medicinska och rekreationella användningsområden är studien av trichome-genuttryck av intresse. För att karakterisera uttrycket av trikomspecifika gener måste trikomerna av intresse först isoleras. Trichome-isoleringsprotokoll beskrevs först så tidigt som 19925, och deras senaste utveckling har nyligen granskats2. I allmänhet kan protokoll för extraktion av glandulära trikomer för transkriptomisk karakterisering delas in i två distinkta sekventiella steg. Det första steget innebär en grundlig fysisk separation av trikomerna från växtvävnaden. Detta steg kan utföras genom att använda torris5, glaspärlor med en kommersiell apparat6,7, slipa växtmaterialet mot en masksikt8 eller virvla växtvävnaden i en isoleringsbuffert9. Det andra steget innebär en mer förfinad separation av trikomerna av intresse från de mikroskopiska växtresterna och / eller andra trikomtyper. Detta steg kan utföras med densitetsgradientcentrifugering 8,10 eller siktar av olika storlekar 7,9. På grund av den extrema känsligheten hos RNA i bearbetade vävnader för nedbrytande medel utförs dessa två sekventiella steg vanligtvis i det iskalla isoleringsmediet, ofta i närvaro av proteinhämmare4.
Konventionella trichome-isoleringsprotokoll kräver, förutom de iskalla temperaturerna, stora mängder isoleringsmedium för att säkerställa ett effektivt extraktionsförfarande. Kombinationen av dessa komponenter resulterar i en mödosam, tidskrävande isoleringsprocess som hindrar hög genomströmning. Att presentera ett enkelt, användarvänligt alternativt trichomeisoleringsprotokoll är därför sannolikt fördelaktigt för olika aspekter i samband med trichome-karakterisering. Detta dokument syftar till att erbjuda ett alternativt protokoll för att isolera stalkade och sittande glandulära kapitita trikomer från Cannabis sativa genom att kombinera och integrera flera element från de konventionella protokollen. Dessa element inkluderar torris5, trikomernas passage genom flera mikrosiktar med minskande porstorlekar 7,9 och ersättning av flytande kväve (LN) för isoleringsmediet8.
Nyheten i det nuvarande trichome-isoleringsprotokollet, jämfört med konventionella protokoll, presenteras på ett antal sätt. Detta protokoll är bekvämt eftersom det inte kräver farliga komponenter. Förfarandet kan utföras i labbet med minimala försiktighetsåtgärder och underlättar hög genomströmning. Att ersätta LN för det vanliga vätskeisoleringsmediet säkerställer trikomernas integritet under hela isoleringsprocessen, vilket möjliggör efterföljande transkriptomisk analys. Vid sublimering av LN och torris lämnas de isolerade trikomerna fria från skadliga rester. Vidare tillåter benägenheten hos LN att sublimera vid rumstemperatur dess generösa användning genom hela protokollet. Däremot genererar användningen av stora volymer konventionellt isoleringsmedium praktiska svårigheter vid hanteringen. Slutligen minskar protokollet separationen av skivcellen från den återstående bräckliga huvudstrukturen i glandulär trikom, vilket möjliggör kvarhållandet av huvudutrymmet.
Detta protokoll presenteras på ett detaljerat steg-för-steg-sätt som är utformat för att hjälpa den tekniska praxisen att isolera C. sativa glandular capitate trichomes. Protokollet ger ett hanterbart arbetsflöde som resulterar i isolerade trikomer med hög koncentration och renhet som är lämpliga för molekylär analys nedströms.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jämfört med de för närvarande tillgängliga trichomeisoleringsprotokollen beskrivs två huvudsakliga modifieringar i detta protokoll. Dessa inkluderar avlägsnande av trikomerna från växtmaterialet med torris i det första steget och ersättning av LN för det vanliga flytande buffertmediet. Den första modifieringen för C. sativa trichome rening är baserad på ett tidigare protokoll som introducerade användningen av krossad torris för att lossa trikomerna från pelargon pediceller5</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner ekonomiskt stöd från CannabiVar Ltd. Allt växtmaterial tillhandahölls generöst av professor Hinanit Koltai från Volcani Center, Israel.
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
