Summary
Her beskriver vi en protokol, der skitserer, hvordan man isolerer humane ovariefollikler fra frosset-optøet kortikalt væv for at udføre genekspressionsanalyser.
Abstract
Æggestokken er et heterogent organ sammensat af forskellige celletyper. For at studere de molekylære mekanismer, der forekommer under follikulogenese, kan lokaliseringen af proteiner og genekspression udføres på fast væv. For korrekt at vurdere genekspressionsniveauer i en menneskelig follikel skal denne komplekse og sarte struktur isoleres. Derfor er en tilpasset protokol, der tidligere er beskrevet af Woodruffs laboratorium, blevet udviklet til at adskille follikler (oocyt- og granulosacellerne) fra deres omgivende miljø. Det kortikale væv i æggestokkene behandles først manuelt for at opnå små fragmenter ved hjælp af to værktøjer: en vævsskærer og en vævshelikopter. Vævet fordøjes derefter enzymatisk med 0,2% kollagenase og 0,02% DNase i mindst 40 min. Dette fordøjelsestrin udføres ved 37 °C og 5 % CO2 og ledsages af mekanisk pipettering af substratet hvert 10. minut. Efter inkubation opsamles de isolerede follikler manuelt ved hjælp af en kalibreret mikrokapillærpipette under mikroskopforstørrelse. Hvis follikler stadig er til stede i vævsstykkerne, afsluttes proceduren med manuel mikrodissektion. Folliklerne opsamles på is i et dyrkningsmedium og skylles to gange i dråber fosfatbufret saltopløsning. Denne fordøjelsesprocedure skal kontrolleres omhyggeligt for at undgå follikelforringelse. Så snart folliklernes struktur synes at være kompromitteret eller efter højst 90 minutter, stoppes reaktionen med en 4 °C-blokerende opløsning indeholdende 10 % føtalt bovint serum. Der skal indsamles mindst 20 isolerede follikler (størrelse under 75 μm) for at opnå en tilstrækkelig mængde total RNA efter RNA-ekstraktion til kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (RT-qPCR). Efter ekstraktion når kvantificeringen af total RNA fra 20 follikler en middelværdi på 5 ng/μL. Det samlede RNA retrotranskriberes derefter til cDNA, og generne af interesse analyseres yderligere ved hjælp af RT-qPCR.
Introduction
Æggestokken er et komplekst organ sammensat af funktionelle og strukturelle enheder, herunder folliklerne i cortex og stroma. Follikulogenese, processen med follikelaktivering, vækst og modning fra en primordial hvilende tilstand til en moden follikel, der kan befrugtes og understøtte tidlig embryonal udvikling, undersøges bredt i forskning1. At optrævle de mekanismer, der driver dette fænomen, kan forbedre fertilitetsplejen for kvinder2. Analyser af fast humant væv gør det muligt at vurdere proteinekspression og genlokalisering inden for ovariens funktionelle enheder 3,4. Imidlertid er specifikke teknikker nødvendige for at adskille folliklerne fra den omgivende cortex for nøjagtigt at vurdere genekspressionsniveauer inden for æggestokkene. Derfor blev der i en tidligere undersøgelse udviklet en follikelisoleringsteknik for at muliggøre analyser af genekspression direkte fra den funktionelle enhed i æggestokken5. Forskellige tilgange er blevet udviklet, såsom enzymatisk fordøjelse og / eller mekanisk isolering samt laserfangstmikrodissektion, der tillader follikelisolering i et stykke væv 6,7,8,9. Follikelisolering anvendes i vid udstrækning, enten med humant eller animalsk ovarievæv, til at evaluere folliklernes genekspressionsprofiler på alle udviklingsstadier10,11,12. En optimal isolationsprocedure bør dog tage højde for follikelens skrøbelige struktur i den tætte cortex og bør derfor udføres med omhu for at undgå skader7. Dette manuskript beskriver en procedure, tilpasset fra en protokol beskrevet af Woodruffs laboratorium, til at isolere humane follikler fra frosne-optøede ovariebark for at udføre genekspressionsanalyser13.
Det første trin i ovariefollikelisolering fra frosset humant væv er optøningsproceduren. Denne proces udføres på grundlag af den kliniske protokol, der anvendes til podning af kryopræserveret ovarievæv, som tidligere beskrevet14,15. Processen sigter mod at fjerne de kryoprotektive midler ved at skylle æggestokkens cortex i faldende koncentrationer af mediet. Derefter fragmenteres vævet før enzymatisk og mekanisk isolering for at hente folliklerne. Follikler på forskellige stadier kan skelnes ved hjælp af et stereomikroskop med høj forstørrelse og optik af god kvalitet for at isolere dem af interesse. Hver isoleret follikel måles ved hjælp af en lineal integreret i mikroskopet, og folliklerne kan samles i henhold til deres udviklingsstadium: primordiale follikler (30 μm), primære follikler (60 μm), sekundære follikler (120-200 μm) og antrale follikler (>200 μm)16. Yderligere klassificering kan udføres i henhold til folliklernes morfologi: primordiale follikler har et lag fladede granulosaceller (GC’er), primære follikler har et lag kuboide GC’er, sekundære follikler har mindst to lag kuboide GC’er, og tilstedeværelsen af et hulrum blandt GC’erne karakteriserer antralstadiet. Når follikler af interesse vælges, udføres RNA-ekstraktion. RNA-mængden og -kvaliteten evalueres forud for kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (RT-qPCR) (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Kryopræservering af ovarievæv er en lovende tilgang til bevarelse af kræftpatienters fertilitet. I klinikken podes optøet kortikalt væv tilbage i patienten efter remission, hvilket muliggør genoptagelse af ovariefunktion og fertilitet19,20. Udover klinisk brug kan resterende ovariefragmenter også doneres til forskning i slutningen af opbevaringsperioden for at studere de mekanismer, der regulerer follikulogenese. Desuden er dette væv særligt nyttigt til …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et Excellence of Science (EOS) tilskud (ID: 30443682). I.D. er associeret forsker ved Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d’Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
- Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
- Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
- Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
- Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
- Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
- McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
- Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
- Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
- Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
- Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
- Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
- Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
- Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
- Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
- Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
- Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Dong, F. -. L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
- Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
- Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
- Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
- Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
