Analisi dell'espressione genica nei follicoli umani
Summary
Qui, descriviamo un protocollo che delinea come isolare i follicoli ovarici umani dal tessuto corticale congelato-scongelato per eseguire analisi di espressione genica.
Abstract
L’ovaio è un organo eterogeneo composto da diversi tipi di cellule. Per studiare i meccanismi molecolari che si verificano durante la follicologenesi, la localizzazione delle proteine e l’espressione genica possono essere eseguite su tessuto fisso. Tuttavia, per valutare correttamente i livelli di espressione genica in un follicolo umano, questa struttura complessa e delicata deve essere isolata. Quindi, un protocollo adattato precedentemente descritto dal laboratorio di Woodruff è stato sviluppato per separare i follicoli (l’ovocita e le cellule della granulosa) dal loro ambiente circostante. Il tessuto corticale ovarico viene prima lavorato manualmente per ottenere piccoli frammenti utilizzando due strumenti: un’affettatrice di tessuto e un tritatutto. Il tessuto viene quindi digerito enzimaticamente con lo 0,2% di collagenasi e lo 0,02% di DNasi per almeno 40 minuti. Questa fase di digestione viene eseguita a 37 °C e al 5% di CO2 ed è accompagnata da pipettaggio meccanico del mezzo ogni 10 minuti. Dopo l’incubazione, i follicoli isolati vengono raccolti manualmente utilizzando una pipetta microcapillare calibrata al microscopio. Se i follicoli sono ancora presenti nei pezzi di tessuto, la procedura viene completata con la microdissezione manuale. I follicoli vengono raccolti su ghiaccio in un terreno di coltura e vengono risciacquati due volte in goccioline di soluzione salina tamponata con fosfato. Questa procedura di digestione deve essere attentamente controllata per evitare il deterioramento del follicolo. Non appena la struttura dei follicoli appare compromessa o dopo un massimo di 90 minuti, la reazione viene interrotta con una soluzione bloccante a 4 °C contenente siero bovino fetale al 10%. Un minimo di 20 follicoli isolati (di dimensioni inferiori a 75 μm) devono essere raccolti per ottenere una quantità adeguata di RNA totale dopo l’estrazione dell’RNA per la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR). Dopo l’estrazione, la quantificazione dell’RNA totale da 20 follicoli raggiunge un valore medio di 5 ng/μL. L’RNA totale viene quindi retrotrascritto in cDNA e i geni di interesse vengono ulteriormente analizzati utilizzando RT-qPCR.
Introduction
L’ovaio è un organo complesso composto da unità funzionali e strutturali, compresi i follicoli all’interno della corteccia e lo stroma. La follicologenesi, il processo di attivazione, crescita e maturazione del follicolo da uno stato quiescente primordiale a un follicolo maturo in grado di essere fecondato e di supportare lo sviluppo embrionale precoce, è ampiamente studiato nella ricerca1. Svelare i meccanismi che guidano questo fenomeno potrebbe migliorare la cura della fertilità per le donne2. Le analisi su tessuto umano fisso permettono di valutare l’espressione proteica e la localizzazione genica all’interno delle unità funzionali dell’ovaio 3,4. Tuttavia, sono necessarie tecniche specifiche per dissociare i follicoli dalla corteccia circostante per valutare con precisione i livelli di espressione genica all’interno dei follicoli ovarici. Quindi, in uno studio precedente, è stata sviluppata una tecnica di isolamento del follicolo per consentire analisi dell’espressione genica direttamente dall’unità funzionale dell’ovaio5. Sono stati sviluppati diversi approcci, come la digestione enzimatica e/o l’isolamento meccanico, così come la microdissezione a cattura laser, che consente l’isolamento del follicolo all’interno di un pezzo di tessuto 6,7,8,9. L’isolamento del follicolo è ampiamente utilizzato, sia con tessuto ovarico umano che animale, per valutare i profili di espressione genica dei follicoli in tutte le fasi dello sviluppo10,11,12. Tuttavia, una procedura di isolamento ottimale dovrebbe tenere conto della fragile struttura del follicolo all’interno della corteccia densa e, pertanto, dovrebbe essere eseguita con cura per evitare danni7. Questo manoscritto descrive una procedura, adattata da un protocollo descritto dal laboratorio di Woodruff, per isolare i follicoli umani dalla corteccia ovarica congelata e scongelata al fine di eseguire analisi di espressione genica13.
Il primo passo dell’isolamento del follicolo ovarico dal tessuto umano congelato è la procedura di scongelamento. Questo processo viene eseguito sulla base del protocollo clinico utilizzato per l’innesto di tessuto ovarico crioconservato, come precedentemente descritto14,15. Il processo mira a rimuovere gli agenti crioprotettori risciacquando la corteccia ovarica in concentrazioni decrescenti del mezzo. Quindi, il tessuto viene frammentato prima dell’isolamento enzimatico e meccanico per recuperare i follicoli. I follicoli in diversi stadi possono essere distinti utilizzando uno stereomicroscopio ad alto ingrandimento e ottica di buona qualità per isolare quelli di interesse. Ogni follicolo isolato viene misurato utilizzando un righello integrato nel microscopio e i follicoli possono essere raggruppati in base al loro stadio di sviluppo: follicoli primordiali (30 μm), follicoli primari (60 μm), follicoli secondari (120-200 μm) e follicoli antrali (>200 μm)16. Un’ulteriore classificazione può essere eseguita in base alla morfologia dei follicoli: i follicoli primordiali hanno uno strato di cellule granulari appiattite (GC), i follicoli primari hanno uno strato di GC cuboidali, i follicoli secondari hanno almeno due strati di GC cuboidali e la presenza di una cavità tra i GC caratterizza lo stadio antrale. Quando vengono selezionati i follicoli di interesse, viene eseguita l’estrazione dell’RNA. La quantità e la qualità dell’RNA vengono valutate prima della reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La crioconservazione del tessuto ovarico è un approccio promettente per preservare la fertilità delle pazienti oncologiche. In clinica, il tessuto corticale scongelato viene innestato nuovamente nella paziente dopo la remissione, consentendo la ripresa della funzione ovarica e della fertilità19,20. Oltre all’uso clinico, frammenti ovarici residui possono anche essere donati per la ricerca alla fine del periodo di conservazione per studiare i meccanismi che reg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione Excellence of Science (EOS) (ID: 30443682). I.D. è ricercatore associato presso il Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
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