Summary
Her beskriver vi en protokoll som beskriver hvordan man isolerer humane eggstokkfollikler fra frosset-tint kortikalt vev for å utføre genuttrykksanalyser.
Abstract
Eggstokken er et heterogent organ sammensatt av forskjellige celletyper. For å studere molekylære mekanismer som forekommer under follikulogenese, kan lokalisering av proteiner og genuttrykk utføres på fast vev. For å kunne vurdere genuttrykksnivåer i en human follikkel, må denne komplekse og delikate strukturen isoleres. Derfor har en tilpasset protokoll tidligere beskrevet av Woodruffs laboratorium blitt utviklet for å skille follikler (oocytten og granulosacellene) fra omgivelsene. Det ovariekortikale vevet behandles først manuelt for å oppnå små fragmenter ved hjelp av to verktøy: en vevskutter og en vevshakker. Vevet blir deretter enzymatisk fordøyd med 0,2% kollagenase og 0,02% DNase i minst 40 minutter. Dette fordøyelsestrinnet utføres ved 37 °C og 5 % CO2 og ledsages av mekanisk pipettering av mediet hvert 10. minutt. Etter inkubering oppsamles de isolerte folliklene manuelt ved hjelp av en kalibrert mikrokapillærpipette under mikroskopforstørrelse. Hvis follikler fortsatt er tilstede i vevsbitene, blir prosedyren fullført med manuell mikrodisseksjon. Folliklene samles på is i et kulturmedium og skylles to ganger i dråper av fosfatbufret saltoppløsning. Denne fordøyelsesprosedyren må kontrolleres nøye for å unngå follikelforringelse. Så snart strukturen i folliklene ser ut til å være kompromittert eller etter maksimalt 90 minutter, stoppes reaksjonen med en 4 °C blokkeringsløsning inneholdende 10% føtalt storfeserum. Minst 20 isolerte follikler (størrelse under 75 μm) bør samles for å oppnå en tilstrekkelig mengde totalt RNA etter RNA-ekstraksjon for sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR). Etter ekstraksjon når kvantifiseringen av totalt RNA fra 20 follikler en middelverdi på 5 ng / μL. Det totale RNA blir deretter retrotranskribert til cDNA, og genene av interesse analyseres videre ved hjelp av RT-qPCR.
Introduction
Eggstokken er et komplekst organ som består av funksjonelle og strukturelle enheter, inkludert folliklene i cortex og stroma. Follikulogenese, prosessen med follikelaktivering, vekst og modning fra en primordial hviletilstand til en moden follikkel som kan befruktes og støtte tidlig embryonal utvikling, er mye studert i forskning1. Å avdekke mekanismene som driver dette fenomenet, kan forbedre fruktbarhetsomsorgen for kvinner2. Analyser på fast humant vev tillater vurdering av proteinuttrykk og genlokalisering innenfor de funksjonelle enhetene i eggstokken 3,4. Imidlertid er det nødvendig med spesifikke teknikker for å dissosiere folliklene fra den omkringliggende cortex for nøyaktig å vurdere genuttrykksnivåer i eggstokkfolliklene. Derfor ble det i en tidligere studie utviklet en follikelisolasjonsteknikk for å tillate analyser av genuttrykk direkte fra den funksjonelle enheten i eggstokken5. Ulike tilnærminger har blitt utviklet, for eksempel enzymatisk fordøyelse og / eller mekanisk isolasjon, samt laserfangstmikrodisseksjon, som tillater follikelisolering i et stykke vev 6,7,8,9. Follikelisolering er mye brukt, enten med eggstokkvev fra mennesker eller dyr, for å evaluere genuttrykksprofilene til follikler i alle stadier av utvikling10,11,12. Imidlertid bør en optimal isolasjonsprosedyre ta hensyn til den skjøre strukturen av follikkelen i den tette cortex og bør derfor utføres med forsiktighet for å unngå skade7. Dette manuskriptet beskriver en prosedyre, tilpasset fra en protokoll beskrevet av Woodruffs laboratorium, for å isolere humane follikler fra frossen-tint ovarial cortex for å utføre genuttrykksanalyser13.
Det første trinnet med ovariefollikelisolasjon fra frosset humant vev er tineprosedyren. Denne prosessen utføres basert på den kliniske protokollen som brukes til poding av kryopreservert eggstokkvev, som tidligere beskrevet14,15. Prosessen tar sikte på å fjerne kryobeskyttelsesmidlene ved å skylle eggstokkbarken i synkende konsentrasjoner av mediet. Deretter fragmenteres vevet før enzymatisk og mekanisk isolasjon for å hente folliklene. Follikler på forskjellige stadier kan skilles ved hjelp av et stereomikroskop med høy forstørrelse og optikk av god kvalitet for å isolere de av interesse. Hver isolerte follikkel måles ved hjelp av en linjal integrert i mikroskopet, og folliklene kan samles i henhold til utviklingsstadiet: primordiale follikler (30 μm), primære follikler (60 μm), sekundære follikler (120-200 μm) og antralfollikler (>200 μm) 16. Ytterligere klassifisering kan utføres i henhold til folliklenes morfologi: primordiale follikler har ett lag flattede granulosaceller (GC), primære follikler har ett lag kuboidale GC, sekundære follikler har minst to lag kuboidale GC, og tilstedeværelsen av et hulrom blant GCene karakteriserer antralstadiet. Når follikler av interesse velges, utføres RNA-ekstraksjon. RNA-kvantitet og -kvalitet evalueres før sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Kryopreservering av eggstokkvev er en lovende tilnærming for å bevare fruktbarheten til kreftpasienter. I klinikken blir tint kortikalt vev podet tilbake i pasienten etter remisjon, slik at ovariefunksjon og fruktbarhet kan gjenopptas19,20. I tillegg til klinisk bruk kan gjenværende ovariefragmenter også doneres til forskning ved slutten av lagringsperioden for å studere mekanismene som regulerer follikulogenese. Dessuten er dette vevet spesielt nyttig for ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et Excellence of Science (EOS) stipend (ID: 30443682). I.D. er forsker ved Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d’Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
- Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
- Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
- Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
- Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
- Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
- McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
- Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
- Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
- Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
- Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
- Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
- Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
- Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
- Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
- Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
- Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Dong, F. -. L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
- Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
- Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
- Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
- Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
