Summary

Análise da Expressão Gênica em Folículos Humanos

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo que descreve como isolar folículos ovarianos humanos de tecido cortical congelado e descongelado para realizar análises de expressão gênica.

Abstract

O ovário é um órgão heterogêneo composto por diferentes tipos celulares. Para estudar os mecanismos moleculares que ocorrem durante a foliculogênese, a localização de proteínas e a expressão gênica podem ser realizadas no tecido fixo. No entanto, para avaliar adequadamente os níveis de expressão gênica em um folículo humano, essa estrutura complexa e delicada deve ser isolada. Assim, um protocolo adaptado descrito anteriormente pelo laboratório de Woodruff foi desenvolvido para separar os folículos (o ovócito e as células da granulosa) de seu ambiente circundante. O tecido cortical ovariano é primeiramente processado manualmente para obter pequenos fragmentos usando duas ferramentas: um fatiador de tecido e um picador de tecido. O tecido é então digerido enzimaticamente com colagenase a 0,2% e DNase a 0,02% por pelo menos 40 min. Esta etapa de digestão é realizada a 37 °C e 5% CO2 e é acompanhada por pipetagem mecânica do meio a cada 10 min. Após a incubação, os folículos isolados são coletados manualmente usando uma pipeta microcapilar calibrada sob magnificação microscópica. Se os folículos ainda estiverem presentes nos pedaços de tecido, o procedimento é completado com microdissecção manual. Os folículos são coletados em gelo em meio de cultura e duas vezes enxaguados em gotículas de solução salina tamponada com fosfato. Este procedimento de digestão deve ser cuidadosamente controlado para evitar a deterioração dos folículos. Assim que a estrutura dos folículos parece estar comprometida ou após um máximo de 90 minutos, a reação é interrompida com uma solução de bloqueio a 4 °C contendo 10% de soro fetal bovino. Um mínimo de 20 folículos isolados (tamanho inferior a 75 μm) deve ser coletado para obter uma quantidade adequada de RNA total após a extração de RNA para reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Após a extração, a quantificação do RNA total de 20 folículos atinge um valor médio de 5 ng/μL. O RNA total é então retrotranscrito em cDNA, e os genes de interesse são posteriormente analisados usando RT-qPCR.

Introduction

O ovário é um órgão complexo composto por unidades funcionais e estruturais, incluindo os folículos dentro do córtex e o estroma. A foliculogênese, processo de ativação, crescimento e maturação dos folículos de um estado quiescente primordial para um folículo maduro capaz de ser fecundado e suportar o desenvolvimento embrionário inicial, é amplamente estudada empesquisa1. Desvendar os mecanismos que impulsionam esse fenômeno poderia melhorar o cuidado da fertilidade para as mulheres2. Análises em tecido humano fixado permitem avaliar a expressão proteica e a localização gênica dentro das unidades funcionais do ovário 3,4. No entanto, técnicas específicas são necessárias para dissociar os folículos do córtex circundante para avaliar com precisão os níveis de expressão gênica dentro dos folículos ovarianos. Assim, em estudo anterior, uma técnica de isolamento de folículos foi desenvolvida para permitir a análise da expressão gênica diretamente da unidade funcional doovário5. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidas, como digestão enzimática e/ou isolamento mecânico, bem como microdissecção por captura a laser, que permitem o isolamento do folículo dentro de um pedaço de tecido 6,7,8,9. O isolamento de folículos é amplamente utilizado, seja com tecido ovariano humano ou animal, para avaliar o perfil de expressão gênica de folículos em todas as fases do desenvolvimento10,11,12. No entanto, um procedimento de isolamento ideal deve levar em conta a frágil estrutura do folículo dentro do córtex denso e, portanto, deve ser realizado com cuidado para evitar qualquer dano7. Este manuscrito descreve um procedimento, adaptado de um protocolo descrito pelo laboratório de Woodruff, para isolar folículos humanos do córtex ovariano congelado descongelado para realizar análises de expressão gênica13.

O primeiro passo do isolamento do folículo ovariano do tecido humano congelado é o procedimento de descongelamento. Esse processo é realizado com base no protocolo clínico utilizado para a enxertia de tecido ovariano criopreservado, conforme descrito anteriormente14,15. O processo visa remover os agentes crioprotetores enxaguando o córtex ovariano em concentrações decrescentes do meio. Em seguida, o tecido é fragmentado antes do isolamento enzimático e mecânico para recuperação dos folículos. Folículos em diferentes estágios podem ser distinguidos usando um estereomicroscópio com alta magnificação e óptica de boa qualidade, a fim de isolar os de interesse. Cada folículo isolado é medido usando uma régua integrada ao microscópio, e os folículos podem ser agrupados de acordo com seu estágio de desenvolvimento: folículos primordiais (30 μm), folículos primários (60 μm), folículos secundários (120-200 μm) e folículos antrais (>200 μm)16. Uma classificação posterior pode ser realizada de acordo com a morfologia dos folículos: os folículos primordiais têm uma camada de células da granulosa (GCs) achatadas, os folículos primários têm uma camada de GCs cuboidais, os folículos secundários têm pelo menos duas camadas de GCs cuboidais e a presença de uma cavidade entre os GCs caracteriza o estágio antral. Quando os folículos de interesse são selecionados, a extração de RNA é realizada. A quantidade e a qualidade do RNA são avaliadas antes da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) (Figura 1).

Protocol

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Erasme (Bruxelas, Bélgica). A paciente incluída neste protocolo foi submetida à criopreservação de tecido ovariano (COT) para preservação da fertilidade antes da exposição à quimioterapia em 2000. A paciente assinou o termo de consentimento livre e esclarecido para doação de seu tecido residual congelado para pesquisa ao final do período de armazenamento. 1. Descongelamento do tecido ovariano criopreservado</strong…

Representative Results

Usando este procedimento de isolamento, o experimentador pode recuperar folículos do ambiente estromal para realizar análises específicas de expressão gênica. Com base no tamanho e morfologia dos folículos, é possível diferenciar os diferentes estágios da foliculogênese. O experimentador pode selecionar folículos de interesse de acordo com seu tamanho usando uma pipeta microcapilar adaptada. Usando um microcapilar de no máximo 75 μm, é possível discriminar folículos primordiais e primários de folículos …

Discussion

A criopreservação do tecido ovariano é uma abordagem promissora para a preservação da fertilidade de pacientes com câncer. Na clínica, o tecido cortical descongelado é enxertado de volta na paciente após a remissão, permitindo a retomada da função ovariana e da fertilidade19,20. Além do uso clínico, fragmentos ovarianos residuais também podem ser doados para pesquisa ao final do período de armazenamento para estudar os mecanismos reguladores da fo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Excelência da Ciência (EOS) (ID: 30443682). I.D. é pesquisador associado do Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

Materials

2 mm gridded Petri dish Corning 430196
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA
2100 Expert software Agilent version B.02.08.SI648
4-wells plate Sigma Aldrich D6789
6-wells plate Carl Roth  EKX5.1
Agilent total RNA 6000 pico kit Agilent 5067-1513
Ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes Sigma Aldrich A5177
Centrifuge Eppendorf 5424R
Collagenase IV LifeTechnologies 17104-019
DMSO Sigma Aldrich D2650
DNase Sigma Aldrich D4527-10kU
FBS Gibco 10270-106
GoScript reverse transcriptase Promega A5003
HSA CAF DCF  LC4403-41-080
Leibovitz-15 LifeTechnologies 11415-049
L-Glutamine Sigma Aldrich G7513
McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes LifeTechnologies 12330-031
McIlwain tissue chopper Stoelting 51350
Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm CooperSurgical 7-72-2200/1
Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm CooperSurgical 7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c operating software ThermoFisher version 1.6
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher 2000/2000c
Penicillin G Sigma Aldrich P3032
PowerTrack SYBR green master mix ThermoFisher A46109
Primers: GDF9 F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Primers: HPRT F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
Primers: Kit Ligand F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
Real-Time qPCR Quantstudio 3 ThermoFisher A33779
RNAqueous-micro total RNA isolation kit ThermoFisher AM1931
Selenium Sigma Aldrich S9133
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636
Stereomicroscope Nikon SMZ800
Streptomycine sulfate Sigma Aldrich S1277
Sucrose Sigma Aldrich S1888
Thermo Scientific Forma Series II  water-jacketed CO2 incubators ThermoFisher 3110
Thomas Stadie-Riggs tissue slicer Thomas Scientific 6727C10
Transferrin Roche  10652202001

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Cite This Article
Devos, M., Dias Nunes, J., Demeestere, I. Gene Expression Analyses in Human Follicles. J. Vis. Exp. (192), e64807, doi:10.3791/64807 (2023).

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