인간 난포의 유전자 발현 분석

Summary

여기에서는 유전자 발현 분석을 수행하기 위해 냉동 해동된 피질 조직에서 인간 난포를 분리하는 방법을 설명하는 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

난소는 서로 다른 세포 유형으로 구성된 이질적인 기관입니다. 모낭 형성 동안 발생하는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 고정 조직에서 단백질 및 유전자 발현의 국소화를 수행 할 수 있습니다. 그러나 인간 난포의 유전자 발현 수준을 적절하게 평가하려면 이 복잡하고 섬세한 구조를 분리해야 합니다. 따라서 Woodruff의 실험실에서 이전에 설명한 적응 된 프로토콜은 난포 (난 모세포 및 과립구 세포)를 주변 환경에서 분리하기 위해 개발되었습니다. 난소 피질 조직은 먼저 조직 슬라이서와 조직 다지기의 두 가지 도구를 사용하여 작은 조각을 얻기 위해 수동으로 처리됩니다. 그런 다음 조직은 최소 40분 동안 0.2% 콜라게나제 및 0.02% DNase로 효소적으로 분해됩니다. 이러한 소화 단계는 37°C 및 5%_CO2 에서 수행되고, 매 10분마다 배지의 기계적 피펫팅이 수반된다. 배양 후, 분리된 모낭은 현미경 확대 하에서 보정된 미세모세관 피펫을 사용하여 수동으로 수집됩니다. 모낭이 조직 조각에 여전히 존재한다면, 절차는 수동 미세 해부로 완료됩니다. 모낭은 배양 배지의 얼음 위에 수집되고 인산염 완충 식염수 방울로 두 번 헹구어집니다. 이 소화 과정은 난포 악화를 피하기 위해 신중하게 제어되어야 합니다. 난포의 구조가 손상된 것으로 나타나자마자 또는 최대 90분 후, 10% 소 태아 혈청을 함유하는 4°C 블로킹 용액으로 반응을 중지시킨다. 실시간 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 위한 RNA 추출 후 적절한 양의 총 RNA를 얻기 위해 최소 20개의 분리된 모낭(크기 75μm 미만)을 수집해야 합니다. 추출 후 20개의 모낭에서 총 RNA를 정량화하면 평균값 5ng/μL에 도달합니다. 그런 다음 전체 RNA를 cDNA로 역전사하고 RT-qPCR을 사용하여 관심 유전자를 추가로 분석합니다.

Introduction

난소는 피질과 간질 내의 난포를 포함하여 기능적 및 구조적 단위로 구성된 복잡한 기관입니다. 난포 형성(folliculogenesis)은 원시 정지 상태에서 수정이 가능하고 초기 배아 발달을 지원할 수 있는 성숙한 난포로 난포의 활성화, 성장 및 성숙 과정으로, 연구¹에서 널리 연구되었다. 이 현상을 유발하는 메커니즘을 밝히면 여성의 불임 관리를 개선할 수 있습니다². 고정된 인간 조직에 대한 분석을 통해 난소의 기능적 단위 내에서 단백질 발현 및 유전자 국소화를 평가할 수 있습니다 ^3,4. 그러나 난소 난포 내의 유전자 발현 수준을 정확하게 평가하기 위해 주변 피질에서 난포를 분리하는 특정 기술이 필요합니다. 따라서 이전 연구에서는 난소의 기능 단위에서 직접 유전자 발현을 분석할 수 있는 난포 분리 기술이 개발되었다⁵. 효소 소화 및/또는 기계적 분리, 레이저 캡처 미세 해부와 같은 다양한 접근법이 개발되어 조직 조각^내에서 난포 분리를 허용합니다 ^....

Protocol

이 프로젝트는 Erasme Hospital Ethical Committee (벨기에 브뤼셀)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 포함된 환자는 2000년 화학 요법에 노출되기 전에 생식력 보존을 위해 난소 조직 냉동 보존(OTC)을 받았습니다. 환자는 보관 기간이 끝날 때 잔여 냉동 조직을 연구에 기증하겠다는 정보에 입각한 서면 동의서에 서명했습니다.

1. 냉동보존된 난소 조직의 해동

1. 5개의 해동 용액을 포함하는 6웰 플레이트를 준비합니다. 첫 번째 웰에는 Leibovitz-15 배지, 0.1mol/L 자당, 1.5mol/L 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 1% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 구성된 5mL의 동결 방지 용액이 들어 있습니다. 다음 웰에는 동결 방지제 농도가 감소하는 5mL의 Leibovitz-15 배지가 포함되어 있습니다: 1 mol/L, 0.5 mol/L 및 2 x 0 mol/L DMSO.
   알림: 동결 방지 용액은 불임 클리닉에서 사용되는 프로토콜에 따라 다를 수 있습니다.
2. 안전 규칙(극저온 장갑, 보호 안경 및 닫힌 신발)에 따라 액체 질소에서 난소 피질 조각이 들어 있는 바이알을 제거하고 튜브를 실온(RT)에서 30초 동안 유지합니다.

Results

이 분리 절차를 사용하여 실험자는 기질 환경에서 모낭을 검색하여 특정 유전자 발현 분석을 수행할 수 있습니다. 난포의 크기와 형태에 따라 모낭 형성의 여러 단계를 구별 할 수 있습니다. 실험자는 적응된 미세모세관 피펫을 사용하여 크기에 따라 관심 있는 모낭을 선택할 수 있습니다. 최대 75μm의 미세모세관을 사용하여 원초모낭과 일차난포를 이차, 전방, 성숙한 난포와 구별할 수 있습니다. 또한, 실험자는 난포 형태에 따라 난포 단계를 확인할 수 있다. 난포 활성화를 연구할 때 정지 및 일차 난포가 선택되며 약 5ng/μL의 RNA 농도에 도달하려면 약 20개의 난포가 필요합니다.

동일한 환자로부터 2개의 균질화된 난소 절편(4mm x 2mm x 1mm)을 처리하여 이 프로토콜을 사용하여 난포를 분리했습니다(그림 2). 1.5시간 분리 절차 후, RNA 양을 비교하고 난포 선택의 관련성을 강조하기 위해 발달 단계에 따라 두 개의 .......

Discussion

난소 조직의 냉동 보존은 암 환자의 생식력을 보존하기 위한 유망한 접근 방식입니다. 클리닉에서 해동 된 피질 조직은 완화 후 환자에게 다시 이식되어 난소 기능과 생식력을 재개 할 수 있습니다^19,20. 임상적 사용 외에도, 잔류 난소 단편은 또한 모낭 형성을 조절하는 메커니즘을 연구하기 위해 저장 기간이 끝날 때 연구를 위해 기증될 수 있습니다. 또한, 이 조직은 체외 배양 시스템이나 인공 난소와 같이 실현 가능하지 않을 때 이식에 대한 대안을 개발하는 데 특히 유용합니다. 그러나 환자 내외의 차이는 실험의 타당성과 재현성 및 결과의 해석을 제한합니다. 실제로, 난포 밀도는 나이가 들면서 급격히 감소하며, 난포는 단편 사이에 균등하게 분포되어 있지 않다²¹. 사용 가능한 조각의 수가 제한되어 있기 때문에 인체 조직은 최첨단 기술과 함께 사용해야 합니다. 면역조직화학 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2mm 격자 페트리 접시	Corning	430196
2100 Bioanalyzer 기기	Agilent	G2939BA
2100 Expert 소프트웨어	Agilent	버전 B.02.08.SI648
4-웰 플레이트	Sigma Aldrich	D6789
6-웰 플레이트	Carl Roth	EKX5.1
Agilent total RNA 6000 pico kit	Agilent	5067-1513
Ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4403
미세모세관 피펫용 흡인기 튜브 어셈블리	Sigma Aldrich	A5177
원심분리기	Eppendorf	5424R
Collagenase IV	LifeTechnologies	17104-019
DMSO	시그마 Aldrich	D2650
DNase	시그마 Aldrich	D4527-10kU
FBS	Gibco	10270-106
GoScript 역전사 효소	Promega	A5003
HSA	CAF DCF	LC4403-41-080
Leibovitz-15	LifeTechnologies	11415-049
L-글루타민	시그마 Aldrich	G7513
McCoy' s 5A + 중탄산염 + Hepes	LifeTechnologies	12330-031
McIlwain 조직 초퍼	Stoelting	51350
Microcapillary RI EZ-Tips 200 µ m	CooperSurgical	7-72-2200/1
마이크로캐필러리 RI EZ-Tips 75 µ m	CooperSurgical	7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c 운영 소프트웨어	ThermoFisher	버전 1.6
NanoDrop 분광 광도계	ThermoFisher	2000/2000c
페니실린 G	시그마 Aldrich	P3032
PowerTrack SYBR 그린 마스터 믹스	ThermoFisher	A46109
프라이머 : GDF9			F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
프라이머: HPRT			F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
프라이머: Kit Ligand			F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
실시간 qPCR Quantstudio 3	ThermoFisher	A33779
RNAqueous-micro total RNA 분리 키트	ThermoFisher	AM1931
셀레늄	시그마 Aldrich	S9133
피루브산 나트륨	시그마 Aldrich	S8636
실체 현미경	Nikon	SMZ800
스트렙토마이신 설페이트	Sigma Aldrich	S1277
자당	시그마 Aldrich	S1888
Thermo Scientific Forma 시리즈 II  방수 CO2  인큐베이터	ThermoFisher	3110
Thomas Stadie-Riggs 조직 슬라이서	Thomas Scientific	6727C10
Transferrin	Roche