Анализ экспрессии генов в фолликулах человека
Summary
Здесь мы описываем протокол, описывающий, как изолировать фолликулы яичников человека из замороженной-размороженной корковой ткани для проведения анализа экспрессии генов.
Abstract
Яичник представляет собой гетерогенный орган, состоящий из разных типов клеток. Для изучения молекулярных механизмов, происходящих во время фолликулогенеза, локализация белков и экспрессия генов могут быть выполнены на фиксированной ткани. Однако, чтобы правильно оценить уровни экспрессии генов в фолликуле человека, эта сложная и тонкая структура должна быть изолирована. Следовательно, адаптированный протокол, ранее описанный лабораторией Вудраффа, был разработан для отделения фолликулов (клеток ооцитов и гранулез) от окружающей их среды. Ткань коры яичников сначала обрабатывается вручную для получения небольших фрагментов с использованием двух инструментов: тканевого слайсера и тканевого измельчителя. Затем ткань ферментативно переваривают 0,2% коллагеназой и 0,02% ДНКазой в течение не менее 40 мин. Эта стадия разложения выполняется при 37 °C и 5% CO2 и сопровождается механическим пипетированием среды каждые 10 минут. После инкубации выделенные фолликулы собирают вручную с помощью калиброванной микрокапиллярной пипетки под микроскопическим увеличением. Если фолликулы все еще присутствуют в кусочках ткани, процедура завершается ручной микродиссекцией. Фолликулы собирают на льду в питательной среде и дважды промывают каплями фосфатно-буферного физиологического раствора. Эту процедуру пищеварения необходимо тщательно контролировать, чтобы избежать разрушения фолликулов. Как только структура фолликулов кажется нарушенной или максимум через 90 минут, реакцию останавливают раствором, блокирующим 4 ° C, содержащим 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Необходимо собрать не менее 20 изолированных фолликулов (размером менее 75 мкм) для получения достаточного количества общей РНК после экстракции РНК для количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-кПЦР). После экстракции количественное определение общей РНК из 20 фолликулов достигает среднего значения 5 нг/мкл. Затем общая РНК ретротранскрибируется в кДНК, а интересующие гены дополнительно анализируются с помощью ОТ-кПЦР.
Introduction
Яичник представляет собой сложный орган, состоящий из функциональных и структурных единиц, включая фолликулы в коре и строму. Фолликулогенез, процесс активации, роста и созревания фолликулов от первичного состояния покоя до зрелого фолликула, способного к оплодотворению и поддержке раннего эмбрионального развития, широко изучается в исследовании1. Раскрытие механизмов, лежащих в основе этого явления, может улучшить лечение бесплодия у женщин2. Анализы фиксированных тканей человека позволяют оценить экспрессию белка и локализацию генов в функциональных единицах яичника 3,4. Тем не менее, необходимы специальные методы для диссоциации фолликулов от окружающей коры, чтобы точно оценить уровни экспрессии генов в фолликулах яичников. Следовательно, в предыдущем исследовании был разработан метод выделения фолликулов, позволяющий анализировать экспрессию генов непосредственно из функциональной единицы яичника5. Были разработаны различные подходы, такие как ферментативное расщепление и/или механическая изоляция, а также микродиссекция с лазерным захватом, которые позволяют изолировать фолликулы в кусочкеткани 6,7,8,9. Выделение фолликулов широко используется как с тканью яичников человека, так и с тканями животных для оценки профилей экспрессии генов фолликулов на всех стадиях развития10,11,12. Тем не менее, оптимальная процедура изоляции должна учитывать хрупкую структуру фолликула в плотной коре и, следовательно, должна выполняться с осторожностью, чтобы избежать каких-либо повреждений7. В этой рукописи описывается процедура, адаптированная из протокола, описанного лабораторией Вудраффа, для выделения фолликулов человека из замороженной-размороженной коры яичников для проведения анализа экспрессии генов13.
Первым этапом выделения фолликулов яичников из замороженных тканей человека является процедура размораживания. Этот процесс выполняется на основе клинического протокола, используемого для трансплантации криоконсервированной ткани яичника, как описано ранее14,15. Процесс направлен на удаление криопротекторов путем промывания коры яичников при снижении концентрации среды. Затем ткань фрагментируется перед ферментативной и механической изоляцией для извлечения фолликулов. Фолликулы на разных стадиях можно различить с помощью стереомикроскопа с большим увеличением и качественной оптикой, чтобы выделить интересующие. Каждый изолированный фолликул измеряется с помощью линейки, встроенной в микроскоп, и фолликулы могут быть объединены в соответствии со стадией их развития: примордиальные фолликулы (30 мкм), первичные фолликулы (60 мкм), вторичные фолликулы (120-200 мкм) и антральные фолликулы (>200 мкм)16. Дальнейшая классификация может быть выполнена по морфологии фолликулов: примордиальные фолликулы имеют один слой уплощенных гранулезных клеток (ГК), первичные фолликулы имеют один слой кубовидных ГК, вторичные фолликулы имеют не менее двух слоев кубовидных ГК, а наличие полости среди ГК характеризует антральную стадию. При отборе интересующих фолликулов проводится экстракция РНК. Количество и качество РНК оцениваются перед количественной полимеразной цепной реакцией в реальном времени (ОТ-кПЦР) (рис. 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Криоконсервация ткани яичников является перспективным подходом для сохранения фертильности онкологических больных. В клинике размороженная кортикальная ткань пересаживается обратно пациентке после ремиссии, что позволяет возобновить функцию яичников и фертильность19,20</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Excellence of Science (EOS) (ID: 30443682). И.Д. является младшим научным сотрудником Национального фонда научных исследований Бельгии (FNRS).
Materials
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d’Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
- Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
- Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
- Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
- Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
- Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
- McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
- Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
- Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
- Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
- Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
- Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
- Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
- Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
- Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
- Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
- Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Dong, F. -. L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
- Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
- Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
- Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
- Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
