Här beskriver vi ett protokoll som beskriver hur man isolerar humana äggstocksfolliklar från fryst tinad kortikal vävnad för att utföra genuttrycksanalyser.
Äggstocken är ett heterogent organ som består av olika celltyper. För att studera de molekylära mekanismer som uppstår under follikulogenesen kan lokalisering av proteiner och genuttryck utföras på fast vävnad. Men för att korrekt bedöma genuttrycksnivåer i en mänsklig follikel måste denna komplexa och känsliga struktur isoleras. Därför har ett anpassat protokoll som tidigare beskrivits av Woodruffs laboratorium utvecklats för att separera folliklar (oocyten och granulosacellerna) från deras omgivande miljö. Den ovariella kortikala vävnaden bearbetas först manuellt för att erhålla små fragment med hjälp av två verktyg: en vävnadsskivare och en vävnadshackare. Vävnaden spjälkas sedan enzymatiskt med 0,2% kollagenas och 0,02% DNas i minst 40 min. Detta uppslutningssteg utförs vid 37 °C och 5 %CO2 och åtföljs av mekanisk pipettering av mediet var 10:e minut. Efter inkubation uppsamlas de isolerade folliklarna manuellt med hjälp av en kalibrerad mikrokapillärpipett under mikroskopförstoring. Om folliklar fortfarande finns i vävnadsbitarna avslutas proceduren med manuell mikrodissektion. Folliklarna samlas på is i ett odlingsmedium och sköljs två gånger i droppar fosfatbuffrad saltlösning. Denna matsmältningsprocedur måste kontrolleras noggrant för att undvika försämring av follikeln. Så snart folliklarnas struktur verkar vara nedsatt eller efter högst 90 minuter stoppas reaktionen med en 4 °C blockerande lösning innehållande 10 % fetalt bovint serum. Minst 20 isolerade folliklar (storlek under 75 μm) bör samlas in för att erhålla en tillräcklig mängd totalt RNA efter RNA-extraktion för kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (RT-qPCR). Efter extraktion når kvantifieringen av totalt RNA från 20 folliklar ett medelvärde på 5 ng / μL. Det totala RNA transkriberas sedan retrotranskriberat till cDNA, och generna av intresse analyseras vidare med RT-qPCR.
Äggstocken är ett komplext organ som består av funktionella och strukturella enheter, inklusive folliklarna i cortex och stroma. Follikulogenes, processen för follikelaktivering, tillväxt och mognad från ett primordialt vilande tillstånd till en mogen follikel som kan befruktas och stödja tidig embryonal utveckling, studeras allmänt i forskning1. Att riva upp mekanismerna som driver detta fenomen kan förbättra fertilitetsvården för kvinnor2. Analyser av fast mänsklig vävnad gör det möjligt att bedöma proteinuttryck och genlokalisering inom äggstockens funktionella enheter 3,4. Emellertid behövs specifika tekniker för att dissociera folliklarna från den omgivande cortexen för att exakt bedöma genuttrycksnivåer inom äggstocksfolliklarna. I en tidigare studie utvecklades därför en follikelisoleringsteknik för att möjliggöra analyser av genuttryck direkt från den funktionella enheten i äggstocken5. Olika tillvägagångssätt har utvecklats, såsom enzymatisk nedbrytning och / eller mekanisk isolering, liksom laserinfångningsmikrodissektion, som möjliggör follikelisolering i en bit vävnad 6,7,8,9. Follikelisolering används i stor utsträckning, antingen med äggstocksvävnad från människa eller djur, för att utvärdera genuttrycksprofilerna för folliklar i alla utvecklingsstadier10,11,12. Ett optimalt isoleringsförfarande bör emellertid ta hänsyn till follikelns bräckliga struktur i den täta cortexen och bör därför utföras med försiktighet för att undvika skador7. Detta manuskript beskriver ett förfarande, anpassat från ett protokoll som beskrivs av Woodruffs laboratorium, för att isolera mänskliga folliklar från fryst tinad äggstocksbark för att utföra genuttrycksanalyser13.
Det första steget i isolering av äggstocksfollikeln från frusen mänsklig vävnad är upptiningsproceduren. Denna process utförs baserat på det kliniska protokoll som används för ympning av kryokonserverad äggstocksvävnad, som tidigare beskrivits14,15. Processen syftar till att avlägsna kryoprotektiva medel genom att skölja äggstocksbarken i minskande koncentrationer av mediet. Därefter fragmenteras vävnaden före enzymatisk och mekanisk isolering för att hämta folliklarna. Folliklar i olika stadier kan särskiljas med hjälp av ett stereomikroskop med hög förstoring och optik av god kvalitet för att isolera de av intresse. Varje isolerad follikel mäts med hjälp av en linjal integrerad i mikroskopet, och folliklarna kan slås samman enligt deras utvecklingsstadium: primordiala folliklar (30 μm), primära folliklar (60 μm), sekundära folliklar (120-200 μm) och antrala folliklar (>200 μm)16. Ytterligare klassificering kan utföras enligt folliklarnas morfologi: primordiala folliklar har ett lager av plana granulosaceller (GC), primära folliklar har ett lager av kuboidala GC, sekundära folliklar har minst två lager av kuboidala GC och närvaron av ett hålrum bland GC: erna kännetecknar antralstadiet. När folliklar av intresse väljs utförs RNA-extraktion. RNA-kvantiteten och kvaliteten utvärderas före kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (RT-qPCR) (figur 1).
Kryokonservering av äggstocksvävnad är ett lovande tillvägagångssätt för att bevara fertiliteten hos cancerpatienter. På kliniken ympas tinad kortikal vävnad tillbaka in i patienten efter remission, vilket möjliggör återupptagande av äggstocksfunktion och fertilitet19,20. Förutom klinisk användning kan kvarvarande äggstocksfragment också doneras för forskning i slutet av lagringsperioden för att studera mekanismerna som reglerar follikulogenes….
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett Excellence of Science (EOS) bidrag (ID: 30443682). I.D. är associerad forskare vid Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
Transferrin | Roche | 10652202001 |