यहां, लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है जो एमआरएनए एन्कोडिंग जुगनू लूसिफेरस को घेरता है। इन एलएनपी का परीक्षण हेपजी 2 कोशिकाओं में विट्रो में और सी 57बीएल /6 चूहों में विवो में उनकी शक्ति के लिए किया गया था।
मॉडर्ना और फाइजर/बायोएनटेक द्वारा कोविड-19 एमआरएनए टीकों के सफल विकास के साथ लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) ने हाल ही में व्यापक ध्यान आकर्षित किया है। इन टीकों ने एमआरएनए-एलएनपी चिकित्सीय की प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है और भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए दरवाजा खोला है। एमआरएनए-एलएनपी प्रणालियों में, एलएनपी डिलीवरी प्लेटफॉर्म के रूप में काम करते हैं जो एमआरएनए कार्गो को न्यूक्लियस द्वारा गिरावट से बचाते हैं और उनके इंट्रासेल्युलर वितरण को मध्यस्थ करते हैं। एलएनपी आमतौर पर चार घटकों से बने होते हैं: एक आयनीय लिपिड, एक फॉस्फोलिपिड, कोलेस्ट्रॉल, और एक लिपिड-लंगर पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) संयुग्म (लिपिड-पीईजी)। यहां, एलएनपी एनकैप्सुलेटेड एमआरएनए एन्कोडिंग जुगनू लूसिफेरस को एलएनपी लिपिड घटकों वाले कार्बनिक चरण और एमआरएनए युक्त जलीय चरण के माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण द्वारा तैयार किया जाता है। इन एमआरएनए-एलएनपी को तब बायोल्यूमिनेसेंट प्लेट-आधारित परख का उपयोग करके हेपजी 2 कोशिकाओं में उनकी अभिकर्मक दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए विट्रो में परीक्षण किया जाता है। इसके अतिरिक्त, पार्श्व पूंछ नस के माध्यम से अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद सी 57बीएल /6 चूहों में विवो में एमआरएनए-एलएनपी का मूल्यांकन किया जाता है। पूरे शरीर की बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग एक इनविवो इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके की जाती है। प्रतिनिधि परिणाम एमआरएनए-एलएनपी विशेषताओं, हेपजी 2 कोशिकाओं में उनकी अभिकर्मक दक्षता और सी 57बीएल / 6 चूहों में कुल ल्यूमिनेसेंट फ्लक्स के लिए दिखाए जाते हैं।
लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) ने गैर-वायरल जीन थेरेपी के क्षेत्र में हाल के वर्षों में महान वादा किया है। 2018 में, यूनाइटेड स्टेट्स फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (एफडीए) ने वंशानुगत ट्रांसथायरेटिन एमाइलॉयडोसिस 1,2,3,4 के इलाज के लिए अल्निलम द्वारा पहली बार आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) चिकित्सीय, ऑनपैट्रो को मंजूरी दी। यह लिपिड नैनोकणों और आरएनए-आधारित उपचारों के लिए एक महत्वपूर्ण कदम था। हाल ही में, मॉडर्ना और फाइजर/बायोएनटेक को सार्स-सीओवी-2 4,5 के खिलाफ अपने एमआरएनए-एलएनपी टीकों के लिए एफडीए की मंजूरी मिली है। इन एलएनपी-आधारित न्यूक्लिक एसिड उपचारों में से प्रत्येक में, एलएनपी अपने कार्गो को न्यूक्लियस द्वारा गिरावट से बचाने और शक्तिशाली इंट्रासेल्युलर डिलीवरी 6,7 की सुविधा प्रदान करने के लिए कार्य करता है। जबकि एलएनपी ने आरएनएआई उपचारों और वैक्सीन अनुप्रयोगों में सफलता देखी है, एमआरएनए-एलएनपी को प्रोटीन रिप्लेसमेंट थेरेपी8 में उपयोग के साथ-साथ कैस 9 एमआरएनए के सह-वितरण के लिए भी खोजा गया है और जीन संपादन9 के लिए सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 प्रणाली के वितरण के लिए आरएनए का मार्गदर्शन किया गया है। हालांकि, कोई एक विशिष्ट सूत्रीकरण नहीं है जो सभी अनुप्रयोगों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, और एलएनपी फॉर्मूलेशन मापदंडों में सूक्ष्म परिवर्तन विवो 8,10,11 में शक्ति और जैव वितरण को बहुत प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, प्रत्येक एलएनपी-आधारित चिकित्सा के लिए इष्टतम सूत्रीकरण निर्धारित करने के लिए व्यक्तिगत एमआरएनए-एलएनपी को विकसित और मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
एलएनपी आमतौर पर चार लिपिड घटकों के साथ तैयार किए जाते हैं: एक आयनीय लिपिड, एक फॉस्फोलिपिड, कोलेस्ट्रॉल, और एक लिपिड-लंगर पॉलीथीन-ग्लाइकोल (पीईजी) संयुग्म (लिपिड-पीईजी) 11,12,13। एलएनपी द्वारा सुगम शक्तिशाली इंट्रासेल्युलर डिलीवरी, आंशिक रूप से, आयनयोग्य लिपिड घटक12 पर निर्भर करती है। यह घटक शारीरिक पीएच पर तटस्थ होता है लेकिन एंडोसोम11 के अम्लीय वातावरण में सकारात्मक रूप से चार्ज हो जाता है। आयनिक चार्ज में इस परिवर्तन को एंडोसोमल एस्केप12,14,15 में एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता माना जाता है। आयनयोग्य लिपिड के अलावा, फॉस्फोलिपिड (हेल्पर लिपिड) घटक कार्गो के एनकैप्सुलेशन में सुधार करता है और एंडोसोमल पलायन में सहायता करता है, कोलेस्ट्रॉल स्थिरता प्रदान करता है और झिल्ली संलयन को बढ़ाता है, और लिपिड-पीईजी परिसंचरण में एलएनपी एकत्रीकरण और ऑप्सनाइजेशन को कम करता है10,11,14,16।. एलएनपी तैयार करने के लिए, इन लिपिड घटकों को एक कार्बनिक चरण में जोड़ा जाता है, आमतौर पर इथेनॉल, और न्यूक्लिक एसिड कार्गो युक्त एक जलीय चरण के साथ मिलाया जाता है। एलएनपी सूत्रीकरण प्रक्रिया बहुत बहुमुखी है क्योंकि यह विभिन्न घटकों को आसानी से प्रतिस्थापित करने और विभिन्न दाढ़ अनुपातों पर संयुक्त करने की अनुमति देती है ताकि भौतिकरासायनिक गुणों की भीड़ के साथ कई एलएनपी योगों को तैयार किया जा सके। हालांकि, एलएनपी की इस विशाल विविधता की खोज करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक फॉर्मूलेशन का मूल्यांकन लक्षण वर्णन और प्रदर्शन में अंतर को सटीक रूप से मापने के लिए एक मानकीकृत प्रक्रिया का उपयोग करके किया जाए।
यहां, एमआरएनए-एलएनपी के निर्माण और कोशिकाओं और जानवरों में उनके प्रदर्शन के आकलन के लिए पूरा वर्कफ़्लो रेखांकित किया गया है।
इस वर्कफ़्लो के साथ, विभिन्न प्रकार के एमआरएनए-एलएनपी को उनके इन विट्रो और विवो दक्षता के लिए तैयार और परीक्षण किया जा सकता है। आयनीय लिपिड और एक्सीपिएंट्स को अलग-अलग मोलर अनुपात और विभिन्न आयनी…
The authors have nothing to disclose.
एमजेएम यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) के निदेशक के न्यू इनोवेटर अवार्ड (डीपी 2 TR002776), साइंटिफिक इंटरफेस (सीएएसआई) में बरोज वेलकम फंड करियर अवार्ड, यूएस नेशनल साइंस फाउंडेशन करियर अवार्ड (सीबीईटी -2145491), और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनसीआई आर 01 CA241661, एनसीआई आर 37 CA244911 और एनआईडीडीके आर 01 DK123049) से अतिरिक्त धन प्राप्त करता है।
0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |