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Biology

एक नए माइक्रो-रेस्पिरोमेट्री टूल का उपयोग करके कोरल होलोबियंट का शारीरिक लक्षण वर्णन

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/64812
Automatic Translation
1, 2, 3
1Minderoo Foundation, 2Marine Scotland Science, 3Australian Institute of Marine Science

Summary

यह प्रोटोकॉल एक माइक्रो-रेस्पिरोमेट्री सिस्टम के सेटअप और रनिंग का वर्णन करता है जिसे कोरल होलोबियंट की शारीरिक विशेषताओं की जांच के लिए नियोजित किया जा सकता है।

Abstract

चयापचय गतिविधि, जिसे ऊर्जा को शामिल करने वाली जीवों की प्रक्रियाओं के योग के रूप में परिभाषित किया गया है, पृथ्वी पर जीवन के कार्य और विकास को समझने में महत्वपूर्ण महत्व है। इसलिए, जीवों की चयापचय दर को मापना जीवों की शारीरिक अवस्थाओं, उनकी पारिस्थितिक भूमिकाओं और स्थलीय और जलीय पारिस्थितिक तंत्र के भीतर प्रजातियों पर पर्यावरणीय परिवर्तन के प्रभाव को समझाने के केंद्र में है। प्रवाल भित्तियों पर, चयापचय के उपायों का उपयोग कोरल और उनके बाध्यकारी अल्गल सहजीवन (सिम्बायोडिनियासी) के बीच सहजीवन कार्य को निर्धारित करने के लिए किया गया है, साथ ही यह आकलन करने के लिए कि जलवायु परिवर्तन सहित पर्यावरणीय तनाव प्रवाल स्वास्थ्य को कैसे प्रभावित करेंगे। इस महत्व के बावजूद, तरीकों की कमी है, और इसलिए डेटा, प्रवाल संतानों में चयापचय दर माप से संबंधित है, संभवतः उनके छोटे आकार के कारण। इस अंतर को संबोधित करने के लिए, इस अध्ययन का उद्देश्य छोटे (मिलीमीटर आकार सीमा) समुद्री पशु पारिस्थितिकी के श्वसन को मापने के लिए एक कस्टम सेटअप विकसित करना है। यह कम लागत और आसान सेटअप चयापचय दर के बेहतर माप के लिए अनुमति देनी चाहिए। यह रीफ बहाली के लिए कोरल के यौन उत्पादन का उपयोग करने वाले लागू पारिस्थितिक अनुसंधान के लिए आवश्यक होगा।

Introduction

श्वसन एक महत्वपूर्ण जैविक माप है जो किसी जीव की समग्र चयापचय गतिविधि को इंगित करता है, लेकिन अन्य महत्वपूर्ण लक्षणों (वृद्धि) की तरह, छोटे जीवों में मापना कठिनहै। श्वसन को ऑक्सीजन के उपयोग के माध्यम से कार्बनिक अणुओं के ऑक्सीकरण के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। यह प्रक्रिया सेलुलर फ़ंक्शन (यानी, चयापचय) के लिए आवश्यक रासायनिक ऊर्जा उत्पन्न करती है, जो जीवों के अस्तित्व के लिए आवश्यक है। वैकल्पिक रूप से, एनारोबिक चयापचय के परिणामस्वरूप ऑक्सीजन ऋण2. श्वसन दर ऑप्टोड का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है जो एक बंद कक्ष में समय के साथ ऑक्सीजन एकाग्रता के उपयोग (और इसलिए कमी) को मापते हैं, एक अभ्यास जिसे आमतौर पर रेस्पिरोमेट्री3 के रूप में जाना जाता है। यह देखते हुए कि अधिकांश जीव ऑक्सीजन को स्टोर नहीं करते हैं, चयापचय की दर को श्वसन और कार्बन उपयोग के बीच सीधे संबंध के माध्यम से अनुमान लगाया जा सकता है। इस वजह से, श्वसन दर को दैनिक कार्बन उपयोग में परिवर्तित किया जा सकता है, जो विकास, प्रजनन, और पर्यावरणीय तनाव 4,5 के समय के दौरान चयापचय होमियोस्टेसिस को बनाए रखने की क्षमता जैसे महत्वपूर्ण चयापचय कार्यों को सूचित करता है, जिसमें हीटवेव की स्थिति शामिल है जो आम तौर पर कोरल में तनाव या विरंजन का कारण बनती है।

प्रवाल भित्तियाँ विश्व स्तर पर त्वरित दर से घट रही हैं। प्रवाल पशु भागीदारों (डाइनोफ्लैगलेट सिम्बायोडिनियासी, कवक, बैक्टीरिया और वायरस सहित) का एक संघ रखता है, जिसे सामूहिक रूप से "होलोबियोंट"6के रूप में जाना जाता है। जैसे-जैसे समुद्र का तापमान बढ़ता है, कोरल और इसलिए प्रवाल भित्तियाँ, जीवित रहने के लिए दबाव में बढ़ रही हैं, क्योंकि उच्च तापमान से डाइनोफ्लैगलेट सिम्बायोडिनियासी (इसके बाद सहजीवन) का नुकसान होता है, एक घटना जिसे ब्लीचिंग7 के रूप में जाना जाता है। कई पोषक तत्व अन्यथा अकार्बनिक नाइट्रोजन और फास्फोरस8 सहित oligotrophic उष्णकटिबंधीय जल में कोरल के लिए अनुपलब्ध हैं. सामना करने के लिए, कोरल अपने डाइनोफ्लैगलेट सहजीवन (सिम्बायोडिनियासी) के साथ एक बाध्यकारी पोषण सहजीवन बनाते हैं, जो प्रवाल मेजबान द्वारा आवश्यक पोषक तत्वों के बहुमत को जीवित रहने और उनके कैल्शियम कार्बोनेट कंकाल 9 जमा करने के लिए प्रदान करतेहैं। एक कामकाज सहजीवन भागीदारों10,11 के बीच कार्बन बंटवारे के उच्च स्तर की विशेषता हो सकती है, और सहजीवन के विनियमन एक गतिशील होमियोस्टेसिस12 शामिल है.

गर्मी के तनाव के दौरान, यह गतिशील विनियमन और संचार बाधित होता है, जिसके परिणामस्वरूप डिस्बिओसिस और ब्लीचिंग होती है (संदर्भ13में समीक्षा की जाती है)। चयापचय माप, जैसे प्रकाश संश्लेषण और श्वसन, इसलिए, कोरल के स्वस्थ और अनियमित, डिस्बिओटिक दोनों राज्यों को स्पष्ट करने की क्षमता रखते हैं, और जीवों के कामकाज को समझने के लिए ऑन्टोजेनी में इन प्रक्रियाओं को सटीक रूप से मापना महत्वपूर्ण है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि बड़े पैमाने पर विरंजन घटनाओं की आवृत्ति और परिमाण में वृद्धि होती है, सहजीवन से पोषक तत्वों के बंटवारे में परिवर्तन को प्रभावित करने की क्षमता के साथ, जहां तापमान14 में वृद्धि के रूप में कार्बन हस्तांतरण कम हो गया है। यह सहजीवन अनुक्रमण पोषक तत्वों द्वारा या कठिन-शारीरिक व्यापार-नापसंद (थर्मल सहिष्णुता में वृद्धि लेकिन मेजबान अस्तित्व 15,16,17 में कमी) से निर्देशित तंत्र के कारण हो सकता है। सहजीवन में व्यवधान सहजीवन और मेजबान दोनों से उपजी हो सकती है, हालांकि एक प्रमुख कारक सहजीवन18 के सेलुलर खराबी की संभावना है। हालांकि, समुद्री जल के तापमान में वृद्धि के कारण तनाव इस सहजीवन को अस्थिर करता है; सहजीवन से मेजबान तक कार्बन साझाकरण19,20 कम हो गया है, और प्रवाल की भुखमरी हो सकती है। यह मेजबान उपयोग में वृद्धि ("निश्चित कार्बन की वृद्धि हुई अपचय") के कारण कोरल में कम लिपिड और कार्बोहाइड्रेट भंडार में परिलक्षित हो सकता है, संभवतः सहजीवन11 द्वारा कम साझा करने के कारण। प्रकाश संश्लेषण और कोरल के सहजीवन के श्वसन के योगदान के साथ-साथ, प्रवाल पशु के श्वसन प्रवाल स्वास्थ्य, इन भागीदारों के बीच विरंजन और पोषक तत्वों के आदान-प्रदान के प्रभावों, और holobiont के विकास, पर्यावरण परिवर्तन 8,21,22 जीवित रहने के लिए प्रासंगिक एक phenotype को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपाय है. अंत में, यह देखते हुए कि कई कोरल सहजीवी हैं, श्वसन के अलावा प्रकाश संश्लेषण को चिह्नित करने के लिए रेस्पिरोमेट्री का उपयोग पी: आर अनुपात को संदर्भित करने और समझने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है कि सहजीवन स्थिर है या नहीं (उदाहरण के लिए, संदर्भ23)।

इसलिए, पर्यावरणीय परिवर्तन, प्रवाल और उसके सहजीवन के ऊर्जा बजट में बदलाव का कारण बनते हैं, जिससे विकास में अंतर होता है14. सामना करने के लिए, प्रवाल मेजबान अपनी चयापचय मांगों को पूरा करने के लिए श्वसन और लिपिड उपयोग बढ़ा सकता है; गर्मी का तनाव इस बढ़ी हुई श्वसन14 के कारण शुद्ध उत्पादकता को 60% तक कम कर सकता है, जैसा कि घुलित ऑक्सीजन में परिवर्तन द्वारा मापा जाता है। सिम्बायोडिनियासी नाइट्रोजन आत्मसात और कार्बन प्रतिधारण14,24 को भी बढ़ा सकता है, और फिर इन भंडारों का उपयोग ऊर्जा को अपनी मरम्मत और सुरक्षात्मक तंत्र 25,26की ओर स्थानांतरित करने के लिए कर सकता है। एन और सी का संतुलन विकास को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और विशेष रूप से27 में पी, जो सहजीवन बहुतायत के गतिशील विनियमन के रूप में प्रकट हो सकता है। दरअसल, बड़े चट्टान विस्तार (>1,000 किमी) भर में कोरल से एकत्र सबूत पता चलता है कि मेजबान पी के विनियमन के माध्यम से सहजीवन विकास को सीमित करने की क्षमता है, हालांकि यह प्रवाल प्रजातियों27 द्वारा भिन्न होता है.

एक साथ लिया गया, ये अध्ययन पर्यावरणीय परिवर्तनों के कारण पोषक तत्वों के उत्पादन या स्थानांतरण (यानी, सहजीवन की प्रवृत्ति) में सहवर्ती कमी के साथ गर्मी सहिष्णुता के लाभ का सुझाव देते हैं। शक्तिशाली एकल-किशोर विधियों, जैसे कि सूक्ष्म-श्वासमिति के माध्यम से ऑक्सीजन के उपयोग की मात्रा निर्धारित करना, इसलिए चयापचय से संबंधित मूलभूत तंत्र को समझने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए और फिर गर्मी सहिष्णुता अधिग्रहण को समझने जैसे संरक्षण प्रश्नों पर लागू किया जाना चाहिए। यह यहां शारीरिक उपायों के लिए एक सूक्ष्म-श्वासमिति उपकरण के रूप में प्रस्तुत किया गया है, जिसका उद्देश्य प्रवाल किशोरों और उनके अल्गल सहजीवन के बीच पोषण संबंधी संबंधों को क्वेरी करना है, लेकिन अन्य छोटे समुद्री जीवों के लिए उपयुक्त है।

जीवों द्वारा ऑक्सीजन के उपयोग या उत्पादन को उन्हें व्यक्तिगत, भली भांति बंद करके सील किए गए श्वासमिति कक्षों या 'रेस्पिरोमीटर' (इसके बाद कक्षों) में रखकर मापा जा सकता है, जहां ऑप्टोड3 का उपयोग करके ऑक्सीजन परिवर्तन को मापा जाता है। ऑप्टोड जांच हैं जो प्रकाश दालों का उपयोग करके ऑक्सीजन एकाग्रता को मापते हैं, और समय के साथ लॉगिंग माप श्वसन और / या प्रकाश संश्लेषण दरों की गणना की अनुमति देता है। व्यवहार में, श्वसन को मापना कोरल में प्रकाश संश्लेषण को मापने के समान है, सिवाय इसके कि कोरल कुल अंधेरे में ऊष्मायन होते हैं। कुल दैनिक प्रकाश संश्लेषण से प्रवाल और सहजीवन के कुल दैनिक श्वसन को घटाने से ऑक्सीजन अंतर (ऑक्सीजन डेल्टा)2,3में परिणाम होता है। आम तौर पर, जीव उत्पादन से अधिक ऑक्सीजन का उपयोग करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कमी होती है। इसे कार्बन समकक्षों में परिवर्तित किया जा सकता है क्योंकि ऑक्सीजन और कार्बन का एक निश्चित अनुपात में सेवन किया जाताहै 2. कार्बन अधिशेष विकास, बलगम संश्लेषण और प्रजनन, और अन्य आवश्यक चयापचय आवश्यकताओं12 के लिए मूंगा द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है.

यह प्रोटोकॉल एक सूक्ष्म-श्वसन विधि (चित्रा 1) का वर्णन करता है जो एक कस्टम-निर्मित 1.5 एमएल ग्लास चैम्बर डिज़ाइन (जीएल 25 धागे के साथ शीशी और 20 मिमी ऊंचा, टक्कर / रिज, फ्लैट-ग्राउंड रिम, और छेद के साथ पेंच टोपी के साथ) का उपयोग करके व्यक्तिगत मूंगा किशोरों के लिए श्वसन (आर) की दरों को मापने के लिए नियोजित किया गया था। फाइबरऑप्टिक ऑप्टोड (सामग्री की तालिकादेखें) ढक्कन के किनारे एक छेद के माध्यम से प्रत्येक कक्ष में डाले गए थे। प्रत्येक व्यक्ति मूंगा कक्ष के भीतर पानी के पर्याप्त मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए एक चुंबकीय हलचल-पट्टी के ऊपर एक कठिन जाल, प्रवाह के माध्यम से उत्तेजक प्लेट मंच के ऊपर संलग्न किया गया था। यहां प्रतिनिधि उदाहरण में, दो नियंत्रण या "रिक्त स्थान" (कक्ष जो नमूने की उपस्थिति को छोड़कर समान थे) को तीन प्रतिकृति नमूना कक्षों के समवर्ती रूप से मापा गया था, क्योंकि हमारे पास एक साथ चलने वाले कई नियंत्रक थे। हालांकि, सेटअप उदाहरण (चित्रा 2) केवल चार चैनलों के उपयोग से पता चलता है; इसे कई नियंत्रकों और कई प्रवाह-थ्रू स्टैंड का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है। इस प्रणाली में तापमान को पूर्व निर्धारित पानी के तापमान (नियंत्रण के लिए 27 डिग्री सेल्सियस या उदाहरण डेटा में उच्च तापमान तनाव के लिए 31 डिग्री सेल्सियस) के साथ कस्टम-निर्मित पानी के स्नान में प्रत्येक कक्ष को जलमग्न करके नियंत्रित किया जा सकता है। स्टिरर प्लेट प्लेटफॉर्म और गियर के साथ स्टिरर प्लेट किसी भी आकार की हो सकती है और ग्लास कक्षों की संख्या को समायोजित करने के लिए आवश्यकतानुसार बड़ी या छोटी बनाई जा सकती है। इस उदाहरण में, मंच और प्लेट लगभग 34 सेमी x 26 सेमी x 3 सेमी (सामग्री की तालिका) थे। ऑप्टोड का अंशांकन इस प्रयोगात्मक सेटिंग के लिए उपयुक्त पानी के तापमान और लवणता पर 0% और 100% ऑक्सीजन संतृप्ति का प्रतिनिधित्व करने वाले दो मानक समाधानों का उपयोग करके प्रत्येक रन से पहले किया गया था।

Protocol

1. श्वसन कक्षों के भीतर उपकरण और कोरल का सेटअप

नोट: प्रजनन के लिए तैयार कोरल (यानी, जिनके पास प्रजातियों एक्रोपोरा टेनुइस कॉलोनियों से खंडित शाखाओं से दिखाई देने वाले गुलाबी रंजित अंडे/शुक्राणु बंडल थे) को अक्टूबर 2018 में पूर्णिमा के दिन चुंबकीय द्वीप (19 ° 6.249'S; 146 ° 51.728'E) में चट्टान से उखाड़ फेंका गया था (परमिट संख्या: G12/35236.1), एकत्र किया गया, और कोरल स्पॉनिंग के लिए प्रयोगशाला में लाया गया, जहां किशोर मूंगे पैदा किए गए और उगाए गए।

  1. माप के दिन, नीले पॉलीपाइप और कनेक्टर्स का उपयोग करके दो पानी के स्नान प्लेटों को कनेक्ट करें ( सामग्री की तालिकादेखें; चित्रा 1 [5], चित्रा 2 ए, बी)। ये नीले पॉलीपाइप के साथ वॉटर हीटर / चिलर से कनेक्शन के बाद इनक्यूबेटर के रूप में काम करेंगे। सुनिश्चित करें कि मोटर प्लेट को पारदर्शी पानी के स्नान प्लेटों के माध्यम से स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है जब श्वासमिति कक्ष जगह में नहीं होते हैं।
  2. दो होसेस को वॉटर हीटर/चिलर से कनेक्ट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। वॉटर हीटर/चिलर चालू करें और फिर वांछित प्रयोगात्मक तापमान (27 डिग्री सेल्सियस या 31 डिग्री सेल्सियस) सेट करें।
  3. पानी के स्नान (चरण 1.1) के आधार को चुंबकीय गियर (चित्रा 1 [6, 7] और चित्रा 3 ए) के साथ बेस मोटर प्लेट से कनेक्ट करें, और फिर इस असेंबली को एक शक्ति स्रोत(चित्रा 3बी)से कनेक्ट करें। गियर को सक्रिय करने के लिए पावर स्रोत चालू करें, जो कक्षों में स्टिरर बार को सक्रिय करेगा।
  4. वाल्व कनेक्टर नॉब्स(चित्रा 3सी)का उपयोग करके आवश्यकतानुसार पानी के प्रवाह को संशोधित करें (उदाहरण के लिए, निरंतर, कोमल प्रवाह 75 एल/एच पर 30 आरपीएम पर धीमी गति से सरगर्मी के साथ सेट करें)।
  5. श्वासमिति कक्ष को इकट्ठा करने के लिए, कांच के कक्ष (चित्र 1 [1.6]) में चुंबकीय मनका (चित्र 1 [1.5]) जोड़ें, और फिर कांच के कक्ष में अपारदर्शी प्लास्टिक प्रवाह-थ्रू स्टैंड बेस (चित्र 1 [1.4]) जोड़ें (चित्र 4A)। कक्ष और चुंबकीय मनका का आकार जीव और ब्याज की अध्ययन प्रणाली पर निर्भर करेगा।
    नोट: तल में चुंबकीय मनका के आंदोलन से पानी के प्रवाह और परिसंचरण की अनुमति देने के लिए प्लास्टिक के आधार में छेद हैं।
  6. मछलीघर गोंद (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके मूंगा को प्लास्टिक बेस (चित्रा 4बी-डी) में रखे काले ज़िप-टाई में गोंद करें। ऐसा करने के लिए, पहले, मूंगा किशोर को काले प्लास्टिक के एक टुकड़े पर गोंद करें, और फिर इस टुकड़े को प्लास्टिक के आधार पर गोंद करें। एक बार मूंगा सुरक्षित रूप से चिपका हुआ है (गोंद का इलाज लगभग तात्कालिक है), कांच के कक्ष पर ओ-रिंग (चित्रा 4 ए) के साथ ढक्कन पेंच। इन क्रियाओं को एक अलग बेसिन में पानी के नीचे करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि श्वसन कक्ष के भीतर कोई हवा नहीं है।
    नोट: रेस्पिरोमीटर में पानी की मात्रा (यानी, प्रभावी मात्रा = 1.5 मिलीलीटर) पानी के नीचे कक्ष के पूर्ण जलमग्न के माध्यम से निर्धारित की गई थी। धारणा यह है कि, पानी की मात्रा के सापेक्ष, बहुत छोटे प्रवाल के द्रव्यमान/घनत्व से विस्थापन नगण्य है। 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को स्केल (चित्रा 4ए) के लिए यहां दिखाया गया है।
  7. मजबूती से पानी के स्नान (चित्रा 5 ए) में कक्षों जगह. सुनिश्चित करें कि कांच के कक्षों प्रयोग के लिए तापमान नियंत्रित पानी के साथ संपर्क में हैं.
  8. ओ2 फाइबर ऑप्टिक केबल्स को कनेक्ट करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ताकि वे ऑक्सीजन सेंसर स्पॉट के संपर्क में हों (इसके बाद स्पॉट के रूप में संदर्भित; सामग्री की तालिकादेखें) उन्हें ढक्कन कक्षों के किनारे ड्रिल किए गए छेद में डालकर। ये छोटे धब्बे ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील होते हैं और फाइबर ऑप्टिक केबल के माध्यम से कक्ष के भीतर से सिग्नल का पता लगाएंगे और संचारित करेंगे।
    1. केबल को अच्छी तरह से फिट करने के लिए प्लंबिंग टेप (सफेद पतली सेल्फ-सीलिंग टेप) जोड़ें और इसे पानी के कक्ष के अंदर मजबूती से रहने दें। सुनिश्चित करें कि व्यक्तिगत मूंगा ( चित्रा 5 बी में देखा के रूप में) देखा जा सकता है, भूरे रंग के जाल के साथ ऊपर का सामना करना पड़ के साथ, कक्ष (चित्रा 5 बी, वीडियो 1) के अंदर.
      नोट: तंत्र में घटकों की लागत अनुमान तालिका 1 में प्रदान की जाती हैं।

2. ओ2 प्रणाली का उपयोग करके श्वसन को मापने के लिए मानक संचालन प्रक्रिया

  1. ऑक्सीजन माप सॉफ्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. उस कमरे के तापमान को मापें जहां अंशांकन किया जाएगा। यह अंशांकन चरण (2.8 कदम) के लिए बाद में की जरूरत हो जाएगा.
  3. ऑप्टिकल सेंसर और कैप इकट्ठा करो। ऐसा करने के लिए, सभी फाइबर ऑप्टिक्स को ओ2 मॉड्यूल में मिलान पोर्ट से कनेक्ट करें। सेंसर 1 के साथ कैप 1, सेंसर 2 के साथ कैप 2, और इसी तरह मिलान करना सुनिश्चित करें।
  4. अंशांकन के लिए कक्षों को स्थापित करने के लिए, पहले रिवर्स ऑस्मोसिस (आरओ) पानी का एक सा के साथ साफ स्पंज का एक टुकड़ा नम और प्रत्येक कक्ष में डालें.
    नोट: स्पंज टपकना नहीं चाहिए, केवल नम होना चाहिए। यह फाइबर ऑप्टिक स्पॉट पर टपक सकता है। सुनिश्चित करें कि अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले स्पॉट गीला नहीं है।
  5. कक्षों को मिलान फाइबर ऑप्टिक(चित्रा 6)के साथ उल्टा रखें। यह फाइबर ऑप्टिक को छूने के बिना कक्ष को खोलना और 0% अंशांकन के लिए सोडियम सल्फाइट जोड़ने की अनुमति देगा।
  6. अंशांकन की शुरुआत से पहले प्रत्येक सेंसर के संकेत की जाँच करें। सॉफ्टवेयर इंटरफेस में सभी टैब के माध्यम से जाओ और संकेत मूल्य (ऊपरी बाएँ कोने) (चित्रा 7 ए) की जांच करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वे महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं हैं। प्रयोगात्मक सेटअप के लिए स्वीकार्य मूल्यों के लिए ओ2 मैनुअल की जांच करें (जीव और ब्याज की शर्तों के आधार पर)। इस विशिष्ट सेटअप के लिए, 25.3 डिग्री सेल्सियस के कमरे के तापमान पर, 179.5 पर सिग्नल के साथ 20.59 का एक एफटीसी (सेल सामान्य सीमा के माध्यम से ऑक्सीजन सेंसर स्पॉट प्रवाह) स्वीकार्य है।
  7. प्रोग्राम खोलें और यह पुष्टि करने के लिए सॉफ़्टवेयर में सेटिंग्स की जाँच करें कि वे नीचे उल्लिखित अनुसार सही हैं। यदि प्रोग्राम खोलने के तुरंत बाद पॉप-अप विंडो दिखाई नहीं देती है, तो यह सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस के बाएँ निचले कोने में सेटिंग बटन पर क्लिक करके किया जा सकता है।
  8. जांचें कि बाहरी तापमान संवेदक सक्रिय है (चित्र 7बी)। सेटिंग को निश्चित तापमान (चित्रा 7C) में बदलें। फिर, कमरे के तापमान का मान जोड़ें और अन्य सभी चैनलों पर कॉपी सेटिंग पर क्लिक करें।
  9. सिग्नल बहाव को कम करने के लिए सेटिंग बदलें (चित्र 7C)। फिर, सेंसर सेटिंग्स का चयन करें और स्तर 2 का चयन करें। अन्यथा, यदि छोटी मात्रा का उपयोग कर रहे हैं, तो बहाव इतना अधिक होगा कि इसे जांचना मुश्किल होगा।
  10. चैनलों की सामान्य सेटिंग्स की जाँच करें। पर्याप्त होने पर ओके दबाएं। सभी चैनलों के लिए सेटिंग्स की प्रतिलिपि बनाएँ क्लिक करें, और उसके बाद ठीकक्लिक करें।
  11. सेंसर को कैलिब्रेट करें। चैनल 1 अंशांकन के लिए, चैनल 1 टैब पर जाएं और कैलिब्रेट बटन दबाएं। पानी या आर्द्र हवा में 2-बिंदु का चयन करें।
  12. "हवा" अंशांकन के लिए, पानी में फोम का एक टुकड़ा डुबकी, कक्ष के अंदर जगह, और संकेत स्थिर करने के लिए प्रतीक्षा (पहले और बाद में हवा अंशांकन छवियों देखें). स्थिर होने पर, "सेट एयर" दबाएं। एयर पर क्लिक करें > कैलिब्रेट करें > सेट एयर करें।
  13. 0% और 100% अंशांकन (चित्रा 7 डी) सेट करें। टोपी से कक्ष निकालें और यह अगले टोपी में जगह इतना है कि हवा अंशांकन संकेत तैयार है जब पहले सेंसर में 0% अंशांकन समाप्त हो गया है. एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करें और 2% सोडियम सल्फाइट के साथ टोपी भरें। सिग्नल के स्थिर होने की प्रतीक्षा करें।
    नोट: सिग्नल आमतौर पर वायु अंशांकन की तुलना में स्थिर होने में अधिक समय लेता है। यदि एक चेतावनी संदेश दिखाई देता है जो कहता है कि "मान विशिष्ट सीमा से बाहर हैं", तो सुनिश्चित करें कि सोडियम सल्फाइट ताजा है। सभी चैनलों के लिए एक ही अंशांकन प्रक्रिया दोहराएँ. आरओ पानी के 100 एमएल में 2 ग्राम जोड़कर सोडियम सल्फाइट तैयार करें।
  14. एक बार अंशांकन पूरा हो गया है, श्वसन कक्षों अच्छी तरह से कुल्ला और कक्षों और टोपी सूखी. सुनिश्चित करें कि फाइबर ऑप्टिक छेद में पानी नहीं है।
  15. जीव (एकल मूंगा किशोर, इस उदाहरण में) को श्वसन कक्षों के अंदर रखें और पलकों के साथ बंद करें। पलकों को रखते समय, इसे तब करना सुनिश्चित करें जब कक्ष पूरी तरह से जलमग्न हों और अंदर बिल्कुल हवा न हो।
  16. कक्षों को मजबूती से सरगर्मी प्लेट में रखें और फाइबर ऑप्टिक्स कनेक्ट करें।
  17. बिजली की आपूर्ति चालू करें। सुनिश्चित करें कि कक्षों के अंदर पानी पूरी तरह से मिश्रित हो जाता है। चिलर/हीटर में तापमान को चुने हुए प्रयोगात्मक तापमान पर सेट करें।
  18. पंप और हीटर चालू करें (चरण 1.2 और 1.4)।
  19. रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए O2 माप सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस पर लॉग दबाएं।

Representative Results

डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण
जबकि रेस्पिरोमेट्री प्रयोगों से कच्चे डेटा को संसाधित करने के कई तरीके हैं, आर पैकेज respR28 का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है। उपरोक्त प्रोटोकॉल के साझाकरण को ध्यान में रखते हुए, जो खुले विज्ञान और प्रजनन क्षमता की वकालत करते हैं, यह पैकेज डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण को आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रूप में साझा करने की अनुमति देता है और इसे ध्यान में रखकर डिजाइन किया गया है। यह एक मुफ़्त, ओपन-सोर्स प्लेटफ़ॉर्म और प्रोब-सिस्टम अज्ञेयवादी है, और CRAN या GitHub से आसानी से इंस्टॉल किया जा सकता है। respR के लिए पूर्ण कोड और उदाहरण बनाए रखे जाते हैं और https://github.com/januarharianto/respR पर पाए जा सकते हैं।

RespR पैकेज में रेस्पिरोमेट्री डेटा पर गुणवत्ता नियंत्रण को आयात करने, कल्पना करने और निष्पादित करने और श्वसन दरों की गणना करने के लिए या तो स्वचालित रूप से या मैन्युअल रूप से चुने गए क्षेत्रों से कार्य होते हैं। यह पृष्ठभूमि श्वसन और आमतौर पर उपयोग की जाने वाली आउटपुट इकाइयों में रूपांतरण दरों को भी समायोजित कर सकता है। माइक्रो-रेस्पिरोमेट्री सिस्टम से डेटा को संसाधित करने के चरण नीचे दिए गए हैं। इस अध्ययन में, रेस्पिरोमेट्री सिस्टम के डेटा का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया गया था, लेकिन पैकेज व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऑक्सीजन जांच प्रणालियों के साथ-साथ जेनेरिक आर डेटा ऑब्जेक्ट्स के बहुमत से इनपुट भी स्वीकार करता है। पूर्ण प्रलेखन और ट्यूटोरियल सहित पैकेज के बारे में अधिक जानकारी पैकेज वेबसाइट पर https://januarharianto.github.io/respR/index.html पर पाई जा सकती है।

कच्चा डेटा आयात करना
कच्चे आउटपुट फ़ाइल (.txt) आयात किया जाता है। respR प्रारूप को पहचानता है और इसे एक सामान्य R डेटा फ्रेम में पार्स करता है जिसका उपयोग बाद के कार्यों में किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह वैकल्पिक है; इन फ़ाइलों और वस्तुतः किसी भी ऑक्सीजन समय श्रृंखला डेटा को आर के बुनियादी ज्ञान वाले किसी भी व्यक्ति द्वारा आधार कार्यों (नीचे दिए गए) का उपयोग करके आयात किया जा सकता है।

#load respR
पुस्तकालय (respR)

#Import ---
डेटा <- import_file("file.txt")
#Firesting-प्रायो फ़ाइल का पता चला

डेटा का निरीक्षण और कल्पना करना
किसी भी डेटा विश्लेषण कार्य का एक महत्वपूर्ण हिस्सा स्पष्ट विसंगतियों या पैटर्न को देखने के लिए डेटा की साजिश और निरीक्षण करना है, या यहां तक कि इसे समझने में मदद करना है। निरीक्षण समारोह का उपयोग यहां किया जाता है (चित्रा 8 ए), जो गैर-संख्यात्मक या लापता मूल्यों जैसे रेस्पिरोमेट्री डेटा के लिए सामान्य मुद्दों की जांच करता है।

एकल ऑक्सीजन स्तंभ #inspect
निरीक्षण <-निरीक्षण (डेटा, समय = 3, ऑक्सीजन = 8, चौड़ाई = 0.2)

यह फ़ंक्शन ऑक्सीजन टाइमसीरीज़ को भी प्लॉट करता है और प्रयोग के दौरान यह दर कैसे बदल सकती है, यह स्पष्ट करने में मदद करने के लिए एक रोलिंग दर (नीचे पैनल) की गणना करता है। ये रोलिंग रेट प्लॉट यह सूचित करने में मदद करते हैं कि उन दर घटता के कौन से क्षेत्रों को निकाला जाना चाहिए। मानक या नियमित चयापचय दर के मामले में, वांछित क्षेत्र वे हैं जहां दर स्थिरता दिखाती है (उदाहरण के लिए, लगभग 3,000 के बाद; चित्रा 8 बी)।

यहां, घटती ऑक्सीजन केवल पूर्ण समय श्रृंखला पैनल में लगभग पंक्ति 200 के बाद पता लगाने योग्य हो जाती है। इस तरह के पैटर्न रेस्पिरोमेट्री डेटा में बहुत आम हैं; एक प्रयोग की शुरुआत में अक्सर अस्थिरता की एक विस्तारित अवधि होती है क्योंकि सिस्टम स्थिर हो जाता है और नमूना प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए अभ्यस्त हो जाता है। यह अनुशंसा की जाती है कि दरों को केवल इस प्रारंभिक अस्थिरता के बाद समय श्रृंखला से निकाला जाना चाहिए, जो विज़ुअलाइज़ेशन के महत्व पर भी प्रकाश डालता है।

दरें निकालें
श्वसन दर निकालने के लिए respR के दो कार्य हैं। पहला calc_rate () फ़ंक्शन है, जो समय, पंक्ति या ऑक्सीजन स्तर के क्षेत्र को निर्दिष्ट करके मैन्युअल रूप से निकालने की अनुमति देता है। यह श्वासमिति विश्लेषण में बहुत आम है, और जब तक चयन मानदंड पर निर्णय लिया जाता है और लगातार28 लागू किया जाता है तब तक दर निर्धारित करने की एक पूरी तरह से स्वीकार्य विधि है।

auto_rate() फ़ंक्शन का उपयोग करने का एक अधिक मजबूत और उद्देश्यपूर्ण तरीका है, जो डेटा के रैखिक क्षेत्रों की पहचान करता है। ये क्षेत्र लगातार निरंतर श्वसन दर वाले हैं, जिन्हें मशीन लर्निंग का उपयोग करके स्वचालित रूप से सौंपा गया है। यह फ़ंक्शन कम संकेतों का पता लगाने के लिए भी उपयोगी है (जैसा कि इस वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए गए नमूनों में, इस उम्र में कम बायोमास के कारण)। यह समारोह स्वतंत्र, उद्देश्य, और सांख्यिकीय रूप से मजबूत तरीकों28 का उपयोग कर सबसे रैखिक, न्यूनतम, और अधिकतम दरों की पहचान के लिए अनुमति देता है. यहां उदाहरण 3,000 से 5,000 के आसपास के समय से होने वाले एक रैखिक क्षेत्र की पहचान करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कई रैखिक क्षेत्रों की पहचान की जा सकती है, लेकिन यह खंड उच्चतम रैंक, या सबसे रैखिक, क्षेत्र(चित्रा 8सी)है।

#Determine सबसे रैखिक (यानी, सुसंगत) दर
दर <-auto_rate (INSP)

पृष्ठभूमि समायोजन
नियंत्रण प्रयोगों से पृष्ठभूमि दरों को उपरोक्त उदाहरण के समान तरीके से निर्धारित किया जा सकता है, और adjust_rate () फ़ंक्शन (चित्रा 9 ए; ध्यान दें कि पूर्ण विश्लेषण यहां नहीं दिखाया गया है, केवल समायोजन) का उपयोग करके नमूना दरों को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पूर्ण उदाहरण respR वेबसाइट पर विस्तृत हैं।

पृष्ठभूमि के लिए #Adjust दर
rate_adj <-adjust_rate(दर, द्वारा = bg) #saved bg वस्तु
प्रिंट(rate_adj)

दरों को बदलें
अंतिम चरण कच्चे डेटा की मूल इकाइयों, रेस्पिरोमीटर की प्रभावी मात्रा, और अन्य प्रयोगात्मक डेटा का उपयोग करके, वांछित आउटपुट इकाइयों में दरों को परिवर्तित करना है, जिसमें रिक्त माप(चित्रा 9बी)को सामान्य करना शामिल है। आउटपुट एक पूर्ण श्वसन दर हो सकता है, जो कि पूरे नमूने का, या एक द्रव्यमान- या सतह क्षेत्र-विशिष्ट दर है। सतह क्षेत्र-विशिष्ट दर यहां उपयोग किया जाने वाला आउटपुट था, जो विशेष रूप से नमूना के सतह क्षेत्र(चित्रा 9सी)से विभाजित पूर्ण दर है।

जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, इस प्रणाली को बहुत छोटे नमूनों को मापने के लिए विकसित किया गया था। इसलिए, हमें रिक्त माप के साथ कम मूल्यों और संभावित ओवरलैप की उम्मीद थी। संकेत के कुछ स्तर रिक्त स्थान के भीतर की उम्मीद है, और जब जांच की, इन मूल्यों सामान्य प्रयोगात्मक शोर की अपेक्षित सीमा के भीतर हैं, संभवतः जांच बहाव, मामूली तापमान में परिवर्तन, या जांच पर बुलबुले के कारण. डिजाइन द्वारा और छोटे नमूने के आकार के कारण, और इसलिए छोटी प्रभावी मात्रा का उपयोग किया जाता है, रिक्त स्थान का उपयोग यहां विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, खासकर प्रत्येक रन के लिए। प्रतिनिधि मूल्यों को यहां एक उदाहरण (चित्रा 10) के रूप में शामिल किया गया है। छोटे नमूने के आकार को देखते हुए, हम प्रति रन माप को मानकीकृत करने के लिए प्रत्येक रन पर रिक्त स्थान के उपयोग की सलाह देते हैं।

इन रिक्त मूल्यों तो उपचार माप मूल्यों मानकीकृत करने के लिए उपयोग किया जाता है. यह देखते हुए कि कोरल ऑक्सीजन के उत्पादन के अलावा श्वसन करते हैं, चयापचय दर नकारात्मक से सकारात्मक मूल्यों तक हो सकती है। सूक्ष्म-श्वसन उपकरण से पता लगाए गए श्वसन मूल्यों की सीमा के प्रतिनिधि परिणामों का एक उदाहरण यहां दिया गया है। ये परिणाम एकल मूंगा किशोर(चित्रा 10)पर एक सफल प्रयोग से निर्धारित किए गए थे। कुल मिलाकर, इस उदाहरण डेटासेट (डिजाइन द्वारा) में श्वसन का पता लगाना मुश्किल होने की उम्मीद थी, नमूनों के छोटे आकार को देखते हुए; यह इस कम सिग्नल थ्रेशोल्ड को कैप्चर करने में इस पद्धति के मूल्य को रेखांकित करता है। ये प्रतिनिधि परिणाम परीक्षण किए गए सबसे छोटे नमूनों के आकार में अंधेरे में श्वसन दिखाते हैं, इस प्रणाली की न्यूनतम पहचान सीमा को रेखांकित करते हैं। हमने दो स्थितियों (नियंत्रण और उच्च तापमान तनाव) के तहत भी मापा। प्रति रन मापा रिक्त स्थान के मानकीकरण के बाद, मूल्यों तनाव उपचार के लिए ~ -5e-5 के एक माध्यिका के लिए शून्य (नियंत्रण) के करीब से लेकर. जैसा कि अपेक्षित था, श्वसन कम था। ये परिणाम स्पष्ट रूप से रिक्त स्थान के लिए प्रतिनिधि मान दिखाते हैं, साथ ही इन बहुत छोटे नमूनों के लिए नियंत्रण बनाम उच्च तापमान तुलना भी दिखाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: प्रवाल होलोबियंट (प्रवाल पशु + सहजीवन) या किसी भी छोटे जीव (<1 मिमी) के शारीरिक लक्षण वर्णन के लिए नए सूक्ष्म श्वासमिति उपकरण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कस्टम श्वासमिति कक्ष बनाए गए (संख्या 1; 1.1-1.6)। इनमें ऑक्सीजन सेंसर स्पॉट (1.2) के साथ ढक्कन (1.1) शामिल हैं, और व्यक्तिगत किशोर (1.3) को एक चुंबकीय उत्तेजक (1.5) के ऊपर फ्लो-थ्रू स्टैंड (1.4) पर रखा गया है, जो सभी ग्लास चैंबर (1.6) के भीतर फिट होते हैं। नियंत्रक (2) एक फाइबर ऑप्टिक केबल के साथ स्पॉट से जुड़ा हुआ है जो ढक्कन (1) में फिट बैठता है और कंप्यूटर (3) से जुड़ा होता है। हीटर/चिलर (4) रेस्पिरोमेट्री प्लेट (5) से फ्लो-थ्रू पानी (दिशा के लिए शेवरॉन तीरों द्वारा इंगित) से जुड़ता है, जो मोटर (6) और बिजली की आपूर्ति (8) द्वारा संचालित गियर (7) के साथ स्टिरर प्लेट (9) के शीर्ष पर बैठता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रो-रेस्पिरोमेट्री सेटअप। कई विकल्प उपलब्ध हैं, जिनमें (ए) एक रेस्पिरोमेट्री प्लेट, या (बी) कई प्लेटों से जुड़ा हुआ है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: रेस्पिरोमेट्री प्लेट के शीर्ष पर कस्टम निर्मित चुंबकीय स्टिरर प्लेट। प्रत्येक कक्ष में (ए) नीचे एक चुंबकीय स्टिरर गियर होता है, (बी) एक मोटर द्वारा संचालित होता है, (सी) रेस्पिरोमेट्री प्लेट हीटर / चिलर से टयूबिंग द्वारा जुड़ा होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: कस्टम श्वासमिति कक्ष सेटअप। (ए) घटक (बाएं से दाएं: ढक्कन, कांच की शीशी, स्टैंड, स्केल के लिए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब, और स्टिरर बार)। (बी) व्यक्तिगत प्रवाह-थ्रू स्टैंड है कि नमूना भीतर बैठता है। (सी) फ्लो-थ्रू स्टैंड का टॉप-डाउन दृश्य। (डी) और ढक्कन के साथ कांच की शीशी के अंदर रखे स्टैंड के साथ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ग्लास शीशियों उत्तेजक प्लेट के भीतर रखा. (ए) कस्टम निर्मित उत्तेजक प्लेट के साथ (बी) ढक्कन सेटअप के साथ पूरा कांच की शीशी का एक क्लोज-अप. किशोर मूंगा को यहां ढक्कन (भूरे रंग के डॉट) के माध्यम से देखा जा सकता है, ज़िप-टाई के ऊपर, ढक्कन खोलने में फाइबर ऑप्टिक रखा गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: कक्षों उल्टा रखा, अंशांकन के लिए तैयार. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: ऑक्सीजन माप सॉफ्टवेयर में महत्वपूर्ण कदम। (ए) प्रत्येक सेंसर के संकेत की जाँच करें। इस अध्ययन और सेंसर के लिए एक इष्टतम संकेत ऑक्सीजन सेंसर स्पॉट एफटीसी (सामान्य सीमा) में दिखाया गया है। (बी) सिग्नल बहाव की जाँच करें। (सी) उपचार तापमान सेट करें और जांचें। (डी) सेट करें और 0% और 100% अंशांकन की जांच करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: respR विश्लेषण आउटपुट चरण I. (A) कमांड और आउटपुट का निरीक्षण करें। (बी) दर स्थिरता की जांच करें। (C) सबसे रैखिक दर निर्धारित कीजिए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: respR विश्लेषण आउटपुट चरण II। (ए) पृष्ठभूमि के लिए दर समायोजित करें, (बी) कन्वर्ट करें और (सी) दरों की जांच करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: माइक्रो-रेस्पिरोमेट्री टूल से उत्पादित प्रतिनिधि परिणाम। व्यक्तिगत प्रवाल किशोरों को दोहराने की माध्य श्वसन (ओ2 ± मानक त्रुटि), जिसमें रिक्त मूल्यों के साथ-साथ नियंत्रण में व्यक्तियों की श्वसन और उच्च तापमान तनाव की स्थिति शामिल है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: एक माप सत्र के दौरान अंदर किशोर मूंगा के साथ श्वासमिति कक्ष के ऊपर से नीचे दृश्य. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: श्वासमिति तंत्र के घटकों की लागत अनुमान। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह काम एक कस्टम-निर्मित माइक्रो-रेस्पिरोमेट्री सेटअप के निर्माण की रूपरेखा तैयार करता है जिसका उपयोग छोटे सेसाइल जलीय जीवों द्वारा खपत और उत्पादित ऑक्सीजन की मात्रा को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण घटकों में धब्बों सहित कक्षों की स्थापना, और respR पैकेज का उपयोग करके कम सिग्नल का अंशांकन शामिल है, जिसमें कम सिग्नल को उथले या शोर ढलानों द्वारा टाइप की गई दरों के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। कस्टम कक्ष और इसका सेटअप कम संकेतों का भी पता लगाने की अनुमति देता है, जबकि आर पैकेज का उपयोग उन मुद्दों से बचाने में मदद करता है जिनमें उथले या शोर ढलानों की घटना परिणामों की गलत व्याख्या (जैसे, गलत-सकारात्मक) का कारण बन सकती है।

अन्य उपयोगकर्ताओं के लिए आवश्यक संभावित संशोधनों में कस्टम-निर्मित कक्ष के भीतर रुचि के जीव को सुरक्षित करना शामिल है। इस मामले में, प्लास्टिक बेस पर एकल किशोर को सुरक्षित करने के लिए एक छोटे, कठोर ज़िप-टाई और एक्वैरियम गोंद का उपयोग किया गया था, जिसे तब टाई से चिपका दिया गया था। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, इस प्रयोग के लिए, मूंगा किशोरों को काले प्लास्टिक की चादर पर बसाया गया था। इस प्लास्टिक ने प्रवाल किशोरों को आसानी से हटाने की अनुमति दी, जो प्रभावी रूप से प्लास्टिक से फिसल गए, ताकि हटाने के दौरान उन्हें शारीरिक रूप से नुकसान न पहुंचे। कोरल किशोर उस सब्सट्रेट से चिपक जाते हैं जिस पर वे बसते हैं, इसलिए ग्लूइंग प्रक्रिया के लिए उनके हटाने की सुविधा के लिए कृत्रिम पेप्टाइड16 का उपयोग करके उन्हें समान प्लास्टिक सामग्री पर व्यवस्थित करने की सिफारिश की जाती है। आगे तनाव से निपटने और श्वसन प्रतिक्रिया पर प्रभाव को कम करने के लिए, यह कोरल 1-2 सप्ताह के लिए acclimate करने के लिए ज़िप संबंधों के लिए घुड़सवार कोरल की अनुमति देने के लिए सिफारिश की है, के रूप में कई वयस्क मूंगा तनाव प्रयोगों में आम है. ढक्कन में स्पॉट के ऊपर जीव को सुरक्षित करने और पानी के संचलन की अनुमति देने के लिए अन्य संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है। एक अन्य महत्वपूर्ण समस्या निवारण चरण में सिग्नल का पता लगाना शामिल है, विशेष रूप से ऑक्सीजन समय-श्रृंखला के ढलान पर जहां दरें निर्धारित की जानी चाहिए। अंततः, यह स्पष्ट रूप से अस्थिर डेटा को बाहर करने के लिए अच्छे निर्णय का उपयोग करने के संयोजन के लिए नीचे आता है, और डेटा के रैखिक क्षेत्रों की पहचान करके दरों को लगातार चुने गए क्षेत्रों से या स्वचालित रूप से निकालने की अनुमति देने के लिए respR के भीतर कार्य करता है। ऐसा करने के तरीके के और उदाहरण respR वेबसाइट पर उपलब्ध हैं।

इस विधि को श्वसन की निचली सीमा के माप को बेहद छोटे, सेसाइल समुद्री अकशेरुकी जीवों तक विस्तारित करने के लिए विकसित किया गया था। स्पष्ट सीमा यह है कि यह प्रोटोकॉल बड़े बायोमास के लिए डिज़ाइन किए गए प्रोटोकॉल की तुलना में झूठी-सकारात्मक होने की अधिक संभावना हो सकती है। हालांकि, यह देखते हुए कि यह डिजाइन का बिंदु था-इन निचली सीमाओं को मापने के लिए-इसे डिजाइन में फैक्टर किया गया है, और प्रक्रिया का उपयोग झूठी-सकारात्मकता के खिलाफ बेहतर सुरक्षा के लिए respR पैकेज के साथ किया जा सकता है। यह भी स्वीकार करना महत्वपूर्ण है कि श्वसन30 को मापने के लिए अन्य प्रणालियां मौजूद हैं, और छोटे जीवों की माप, जिसमें व्यक्तिगत कोपपोड्स31 पर रेस्पिरोमेट्री शामिल है, इस (~ 0.5-1 एमएल) की तुलना में छोटी मात्रा में, लेकिन या तो महंगे हैं या विशिष्ट घटकों (सरगर्मी क्षमता) की कमी है। हालांकि, यह प्रणाली वाणिज्यिक प्रणालियों (जैसे, कोर माइक्रोप्लेट सिस्टम) की तुलना में ओपन-सोर्स और सापेक्ष कम लागत वाली है। इस प्रणाली में सरगर्मी जैसे प्रमुख पद्धतिगत विचार भी शामिल हैं, जिनमें अन्य प्रणालियों की कमी हो सकती है। कई समुद्री जीवों (जैसे, तैराकी के माध्यम से कोपपोड्स) के प्राकृतिक जल मिश्रण को दोहराने के लिए आंतरिक सरगर्मी बार सुविधा आवश्यक है, जो अक्सर संभव नहीं होता है और डेटा को काफी हद तक अनुपयोगी बना सकता है। इसके विपरीत, उपलब्ध अन्य मिश्रण विधियों में पूरे रेस्पिरोमीटर को एक विशाल घुमाव बेंच पर रखना शामिल है, जिसके लिए अतिरिक्त उपकरण की आवश्यकता होती है और कंपन के माध्यम से मिश्रण या मिश्रण में सीमित सफलता होती है, जिससे जीव को गड़बड़ी हो सकती है। इस कारण से, यह एकमात्र प्रणाली है जो किशोर कोरल या अन्य बहुत छोटे सेसाइल जीवों पर श्वासमिति कर सकती है। संदर्भ के लिए, यहां शामिल नमूनों की आकार सीमा 2.1 से 3.6 पॉलीप्स (केवल कुछ महीनों के अनुरूप) तक थी, जिसमें न्यूनतम से अधिकतम औसत क्षेत्र 1.3 से 4.5 मिमी2 था।

रेस्पिरोमेट्री पारिस्थितिक अध्ययन में एक मौलिक उपाय है, और इस उद्देश्य के लिए कई तरीके मौजूद हैं। इन मौजूदा तरीकों में से अधिकांश, तथापि, पूरे मछली, मूंगा टुकड़े, या समुद्री घास 32,33,34 सहित उच्च बायोमास नमूने, लक्ष्य. यह विधि व्यक्तिगत प्रवाल किशोरों का उपयोग करने वाली पहली विधि है। इसके अलावा, इस पद्धति के लिए कई संभावित अनुप्रयोग हैं, क्योंकि यह जीव के कामकाज के बारे में महत्वपूर्ण शारीरिक जानकारी प्रदान करता है। यह आधारभूत स्वास्थ्य अनुमानों35 को चिह्नित करने के लिए देख रहे अध्ययनों के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, प्रवाल ऑन्टोजेनी के दौरान तीव्र या दीर्घकालिक तनाव की भूमिका को समझें जैसे कि गर्मीतनाव 36, या थ्रेसहोल्ड प्रदान करने के लिए जो प्रबंधक प्रवाल भित्तियों के स्वास्थ्य की रक्षा और सुधार में मदद करने के लिए सेट कर सकते हैं37. यह देखते हुए कि मूंगा एक होलोबियंट है और सहजीवन समुदाय इस स्तर पर अपेक्षाकृत लचीला है और जीवन के पहले वर्ष38 के दौरान, समय के साथ समुदायों में परिवर्तन के साथ श्वसन डेटा को जोड़ना दिलचस्प होगा, ताकि जीव के कामकाज को पूरी तरह से प्रासंगिक बनाया जा सके। महत्वपूर्ण रूप से, यह विधि 'ओपन साइंस' तकनीकों में योगदान देती है जो कस्टम प्रयोगात्मक सेटअप बनाने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करने में मदद करती है जिसे खुले तौर पर साझा, सुधार और मानकीकृत किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक सैम नूनन को उनकी मदद और सलाह के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, प्रारंभिक रेस्पिरोमेट्री कक्षों के उपयोग के लिए स्वेन उथिक, उनके इंजीनियरिंग चित्रण के लिए बेन शेलाब, और रेस्पिरोमेट्री चैंबर एडेप्टर और धारकों के बीस्पोक मशीनिंग के लिए ऑस्ट्रेलियाई समुद्री विज्ञान कार्यशाला के लिए कार्यशाला। कोरल को निम्नलिखित ग्रेट बैरियर रीफ मरीन पार्क परमिट के तहत AIMS G12/35236.1 के तहत एकत्र किया गया था। कोरल को नैतिकता परमिट की आवश्यकता नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Cost
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers  LabGlass Party Ldt. 1.5 ml $407.26
1.1 lids AIMS workshop Vial GL25 thread ~$10
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) PyroScience Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 $41.25 AUD each
1.3 individual organism  NA NA NA
1.4 flow-through stand  AIMS workshop Custom included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through
1.5 magnetic stirrer  Any manufactuer is suitable NA ~$2?
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) Labglass Pty Ltd, Stafford QLD Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole $50.9 AUD
2 FireSting controller (2)  PyroSciences NA 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here.
3 computer  NA NA NA
4 heater/chiller  VWR International NA Small models around $4,000 AUD
5 respirometry plate platform AIMS workshop 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers)  $1250 AUD
6 stirrer plate with gears (7) AIMS workshop 34 cm x 26 cm x 3 cm  $1250 AUD
8 powered by the motor  AIMS workshop Custom $700 AUD
9 power supply Non-specific NA ~$300 AUD
Aquarium glue Seachem reef glue 20g $14
Oxygen Logger Software PyroScience  NA NA
Polypipe and connectors John Guest NA $20
Sodium Sulfite Sigma S0505-250G (CAS number 7757-83-7) $54

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References

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जीवविज्ञान अंक 194 माइक्रो-रेस्पिरोमेट्री टूल मेटाबोलिक गतिविधि जीव प्रक्रियाएं चयापचय दर को मापना पारिस्थितिक भूमिकाएं पर्यावरण परिवर्तन प्रवाल भित्तियाँ सहजीवन कार्य अल्गल सहजीवन पर्यावरण तनाव जलवायु परिवर्तन प्रवाल स्वास्थ्य चयापचय दर माप प्रवाल संतान कस्टम सेटअप श्वसन माप छोटे समुद्री पशु पारिस्थितिकी कम लागत सेटअप चयापचय दर का बेहतर माप एप्लाइड पारिस्थितिक अनुसंधान कोरल का यौन उत्पादन रीफ बहाली
एक नए माइक्रो-रेस्पिरोमेट्री टूल का उपयोग करके कोरल होलोबियंट का शारीरिक लक्षण वर्णन
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Quigley, K., Carey, N., Alvarez Roa, … More

Quigley, K., Carey, N., Alvarez Roa, C. Physiological Characterization of the Coral Holobiont Using a New Micro-Respirometry Tool. J. Vis. Exp. (194), e64812, doi:10.3791/64812 (2023).

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