Investigación de los efectos protectores de la platycodin D en la enfermedad del hígado graso no alcohólico en un modelo in vitro inducido por ácido palmítico

Summary

Este protocolo investiga los efectos protectores de la platycodin D sobre la enfermedad del hígado graso no alcohólico en un modelo in vitro inducido por ácido palmítico.

Abstract

La incidencia de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) ha aumentado a un ritmo alarmante en todo el mundo. Platycodon grandiflorum es ampliamente utilizado como etnomedicina tradicional para el tratamiento de diversas enfermedades y es un alimento funcional típico que se puede incorporar a la dieta diaria. Los estudios han sugerido que la platycodin D (PD), uno de los principales ingredientes activos de Platycodon grandiflorum, tiene una alta biodisponibilidad y mitiga significativamente el progreso de NAFLD, pero el mecanismo subyacente de esto aún no está claro. Este estudio tiene como objetivo investigar el efecto terapéutico de la EP contra la EHGNA in vitro. Las células de AML-12 se trataron previamente con ácido palmítico (PA) de 300 μM durante 24 h para modelar NAFLD in vitro. Luego, las células fueron tratadas con EP o no recibieron tratamiento con EP durante 24 h. Los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) se analizaron mediante tinción de diacetato de 2′,7′-dicloro-dihidrofluoresceína (DCFH-DA), y el potencial de membrana mitocondrial se determinó mediante el método de tinción JC-1. Además, los niveles de expresión proteica de LC3-II/LC3-I y p62/SQSTM1 en los lisados celulares se analizaron mediante western blotting. Se encontró que la EP disminuye significativamente los niveles de ROS y potencial de membrana mitocondrial en el grupo tratado con PA en comparación con el grupo control. Mientras tanto, la DP aumentó los niveles de LC3-II/LC3-I y disminuyó los niveles de p62/SQSTM1 en el grupo tratado con PA en comparación con el grupo control. Los resultados indicaron que la EP mejoró la NAFLD in vitro al reducir el estrés oxidativo y estimular la autofagia. Este modelo in vitro es una herramienta útil para estudiar el papel de la EP en la EHGNA.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), que es la raíz seca de Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., se utiliza en la medicina tradicional china (MTC). Se produce principalmente en las regiones noreste, norte, este, centro y suroeste de China¹. Los componentes PG incluyen saponinas triterpenoides, polisacáridos, flavonoides, polifenoles, polietilenglicoles, aceites volátiles y minerales². PG tiene una larga historia de ser utilizado como un alimento y una medicina herbal en Asia. Tradicionalmente, esta hierba se usaba para hacer medicamentos contra las enfermedades pulmonares. La farmacología moderna también proporciona evidencia de la eficacia de PG para tratar otras enfermedades. Los estudios han demostrado que PG tiene un efecto terapéutico en una variedad de modelos de lesión hepática inducida por fármacos. La suplementación dietética de extractos de PG o platycodin puede mejorar la obesidad inducida por la dieta alta en grasas y sus enfermedades metabólicas relacionadas ^3,4,5. Los polisacáridos de PG se pueden utilizar para el tratamiento de la lesión hepática aguda causada por LPS / D-GalN en ratones⁶. Además, las saponinas de las raíces de PG mejoran la esteatohepatitis no alcohólica inducida por la dieta alta en grasas (EHNA)⁷. Además, la platycodin D (PD), uno de los componentes terapéuticos más importantes de PG, puede mejorar la expresión del receptor de lipoproteínas de baja densidad y la captación de lipoproteínas de baja densidad en células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2)⁸. Además, la EP también puede inducir apoptosis e inhibir la adhesión, migración e invasión en las células HepG2 ^9,10. Por lo tanto, en este estudio, las células de ratón de hepatoma AML-12 se utilizan para la construcción de modelos in vitro y para estudiar más a fondo los efectos farmacológicos y los mecanismos subyacentes de la EP en este modelo.

El término enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) se refiere a un grupo de enfermedades hepáticas que incluye esteatosis simple, NASH, cirrosis y carcinoma hepatocelular¹¹. Aunque la patogénesis de NAFLD no se comprende completamente, desde la teoría clásica de “dos golpes” hasta la teoría actual de “múltiples golpes”, la resistencia a la insulina se considera central en la patogénesis de NAFLD^12,13,14. Los estudios han demostrado que la resistencia a la insulina en los hepatocitos podría conducir a un aumento de los ácidos grasos libres, que forman triglicéridos que se depositan en el hígado y hacen que el hígado se vuelva graso^15,16. La acumulación de grasa puede conducir a lipotoxicidad, disfunción mitocondrial inducida por estrés oxidativo, estrés del retículo endoplásmico y liberación de citoquinas inflamatorias, lo que resulta en la patogénesis y progresión de NAFLD^17,18. Además, la autofagia también juega un papel en la patogénesis de NAFLD, ya que está involucrada en la regulación de la sensibilidad celular a la insulina, el metabolismo lipídico celular, la lesión de hepatocitos y la inmunidad innata 19,20,21.

Se han establecido una variedad de modelos animales y modelos celulares para proporcionar una base para explorar la patogénesis y los posibles objetivos terapéuticos de NAFLD^22,23. Sin embargo, los modelos de un solo animal no pueden imitar completamente todos los procesos patológicos de NAFLD²⁴. Las diferencias individuales entre los animales conducen a diferentes características patológicas. El uso de líneas celulares hepáticas o hepatocitos primarios en estudios in vitro de NAFLD garantiza la máxima consistencia en las condiciones experimentales. La desregulación del metabolismo lipídico hepático puede conducir a niveles más altos de acumulación de gotitas lipídicas de hepatocitos en NAFLD²⁵. Los ácidos grasos libres como el ácido oleico y el aceite de palma han sido utilizados en el modelo in vitro para imitar la EHGNA causada por una dieta alta en grasas^26,27. La línea celular de hepatoblastoma humano HepG2 se utiliza a menudo en la construcción de modelos de NAFLD in vitro, pero, como línea celular tumoral, el metabolismo de las células HepG2 es significativamente diferente del de las células hepáticas en condiciones fisiológicas normales²⁸. Por lo tanto, el uso de hepatocitos primarios o hepatocitos primarios de ratón para construir el modelo in vitro de NAFLD para la detección de fármacos es más ventajoso que el uso de líneas celulares tumorales. Al comparar el examen sinérgico de los efectos de los fármacos y las dianas terapéuticas tanto en modelos animales como en modelos de hepatocitos in vitro, parece que el uso de hepatocitos de ratón para construir el modelo de hígado graso no alcohólico in vitro tiene un mejor potencial de aplicación.

Los ácidos grasos libres que entran en el hígado se oxidan para producir energía o se almacenan como triglicéridos. Significativamente, los ácidos grasos libres tienen cierta lipotoxicidad y pueden inducir disfunción celular y apoptosis¹². El ácido palmítico (AP) es el ácido graso saturado más abundante en el plasma humano²⁹. Cuando las células en el tejido no adiposo están expuestas a altas concentraciones de PA durante mucho tiempo, esto estimula la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y causa estrés oxidativo, acumulación de lípidos e incluso apoptosis³⁰. Por lo tanto, muchos investigadores utilizan PA como inductor para estimular las células hepáticas para producir ROS y, así, construir el modelo de enfermedad del hígado graso in vitro y evaluar los efectos protectores de ciertas sustancias activas en las células^31,32,33,34. Este estudio introduce un protocolo para investigar los efectos protectores de la EP en un modelo celular de NAFLD inducida por PA.

Protocol

Las células AML-12 (una línea celular normal de hepatocitos de ratón) se utilizan para los estudios basados en células. Las células se obtienen de una fuente comercial (ver Tabla de materiales). 1. Pretratamiento de las células AML-12 para modelar NAFLD in vitro Mantener las células en medios de cultivo celular normales (DMEM más F12 [1:1] de Ham que contiene 0,005 mg/ml de insulina, 5 ng/ml de selenio, 0,005 mg/ml de transferrina, …

Representative Results

ROS intracelular en las célulasSe indujeron células AML-12 con 300 μM PA durante 24 h, y se estableció un modelo de células NAFLD. Posteriormente, las células fueron tratadas con DP durante 24 h. Las células se marcaron con una sonda fluorescente DCFH-DA, y la producción de ROS se observó bajo un microscopio de fluorescencia. Los resultados de la tinción DCFH-DA de ROS intracelulares en las células se muestran en la Figura 1. Los resultados mostraron que la EP…

Discussion

Estudios han destacado el hecho de que NAFLD es un síndrome clínico-patológico, que va desde el hígado graso hasta NASH, que puede progresar a cirrosis y cáncer de hígado⁵¹. Una dieta alta en grasas y un estilo de vida inactivo son factores de riesgo típicos para NAFLD. Tanto las terapias no farmacológicas como las terapias farmacológicas para el tratamiento de NAFLD se han investigado^51,52,53. S…

Materials

5% BSA Blocking Buffer	Solarbio, Beijing, China	SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line	Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China	AML12
Beyo ECL Plus	Beyotime, Shanghai, China	P0018S
Bio-safety cabinet	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	AC2-5S1 A2
cellSens	Olympus, Tokyo, Japan	1.8
Culture CO2 Incubator	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	CCL-170B-8
Dexamethasone	Beyotime, Shanghai, China	ST125
Dimethyl sulfoxide	Solarbio, Beijing, China	D8371
DMEM/F12	Hyclone, Logan, UT, USA	SH30023.01
Foetal Bovine Serum	Hyclone, Tauranga, New Zealand	SH30406.05
Graphpad software	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	ABclonal, Wuhan, China	AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane	Merck, Darmstadt, Germany	IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×	Beyotime, Shanghai, China	C0341
MAP LC3β Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1	Solarbio, Beijing, China	M8650
Olympus Inverted Microscope IX53	Olympus, Tokyo, Japan	IX53
Palmitic Acid	Sigma, Germany	P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	Hyclone, Logan, UT, USA	SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Beyotime, Shanghai, China	ST506
Phosphate Buffered Solution	Hyclone, Logan, UT, USA	BL302A
Platycodin D	Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China	CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x	Beyotime, Shanghai, China	P1005
Protein Marker	Solarbio, Beijing, China	PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit	Solarbio, Beijing, China	CA1410
RIPA Lysis Buffer	Beyotime, Shanghai, China	P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit	Beyotime, Shanghai, China	P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Beyotime, Shanghai, China	P0015
Sigma Centrifuge	Sigma, Germany	3K15
SQSTM1/p62 Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO	Tecan Austria GmbH, Austria	1510002987
WB Transfer Buffer,10x	Solarbio, Beijing, China	D1060
β-Actin Mouse mAb	ABclonal, Wuhan, China	AC004