Bu protokol, palmitik asit kaynaklı in vitro modelde platikodin D’nin alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı üzerindeki koruyucu etkilerini araştırmaktadır.
Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının (NAFLD) görülmesi dünya çapında endişe verici bir oranda artmaktadır. Platycodon grandiflorum , çeşitli hastalıkların tedavisi için geleneksel bir etnotilaç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ve günlük diyete dahil edilebilecek tipik bir fonksiyonel besindir. Çalışmalar, Platycodon grandiflorum’daki ana aktif bileşenlerden biri olan platycodin D’nin (PD) yüksek biyoyararlanıma sahip olduğunu ve NAFLD’nin ilerlemesini önemli ölçüde azalttığını ileri sürmüştür, ancak bunun altında yatan mekanizma hala belirsizdir. Bu çalışma, PD’nin NAFLD’ye karşı terapötik etkisini in vitro olarak araştırmayı amaçlamaktadır. AML-12 hücreleri, NAFLD’yi in vitro olarak modellemek için 24 saat boyunca 300 μM palmitik asit (PA) ile ön işlemden geçirildi. Daha sonra, hücreler ya PD ile tedavi edildi ya da 24 saat boyunca PD tedavisi almadı. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) seviyeleri 2′,7′-dikloro-dihidro-floresein diasetat (DCFH-DA) boyaması kullanılarak analiz edildi ve mitokondriyal membran potansiyeli JC-1 boyama yöntemi ile belirlendi. Ayrıca, hücre lizatlarındaki LC3-II / LC3-I ve p62 / SQSTM1 protein ekspresyon seviyeleri batı lekelenmesi ile analiz edildi. PD’nin, PA ile tedavi edilen grupta ROS ve mitokondriyal membran potansiyel düzeylerini kontrol grubuna göre anlamlı derecede azalttığı bulundu. Bu arada, PD, kontrol grubuna kıyasla PA ile tedavi edilen grupta LC3-II / LC3-I seviyelerini arttırdı ve p62 / SQSTM1 seviyelerini düşürdü. Sonuçlar, PD’nin oksidatif stresi azaltarak ve otofajiyi uyararak NAFLD’yi in vitro olarak iyileştirdiğini göstermiştir. Bu in vitro model, NAFLD’de PD’nin rolünü incelemek için yararlı bir araçtır.
Platycodon grandiflorus (PG), Platycodon grandiflorus’un (Jacq.) kurutulmuş köküdür. A.DC., geleneksel Çin tıbbında (TCM) kullanılır. Esas olarak Çin1’in kuzeydoğu, kuzey, doğu, orta ve güneybatı bölgelerinde üretilmektedir. PG bileşenleri arasında triterpenoid saponinler, polisakkaritler, flavonoidler, polifenoller, polietilen glikoller, uçucu yağlar ve mineraller2 bulunur. PG, Asya’da gıda ve bitkisel ilaç olarak kullanılma konusunda uzun bir geçmişe sahiptir. Geleneksel olarak, bu bitki akciğer hastalıklarına karşı ilaç yapmak için kullanılmıştır. Modern farmakoloji ayrıca PG’nin diğer hastalıkların tedavisinde etkinliğine dair kanıtlar sağlar. Çalışmalar, PG’nin çeşitli ilaca bağlı karaciğer hasarı modelleri üzerinde terapötik bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir. PG veya platikodin ekstraktlarının diyet takviyesi, yüksek yağlı diyete bağlı obeziteyi ve buna bağlı metabolik hastalıkları iyileştirebilir 3,4,5. PG’den polisakkaritler, farelerde LPS / D-GalN’nin neden olduğu akut karaciğer hasarının tedavisi için kullanılabilir6. Ayrıca, PG köklerinden gelen saponinler, yüksek yağlı diyete bağlı alkolsüz steatohepatiti (NASH) iyileştirir7. Ayrıca, PG’nin en önemli terapötik bileşenlerinden biri olan platikodin D (PD), insan hepatosellüler karsinom (HepG2) hücrelerinde düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör ekspresyonunu ve düşük yoğunluklu lipoprotein alımını artırabilir8. Ayrıca, PD ayrıca apoptozu indükleyebilir ve HepG2 hücrelerinde adezyon, migrasyon ve invazyonu inhibe edebilir 9,10. Bu nedenle, bu çalışmada, fare hepatoma AML-12 hücreleri in vitro model yapımında ve bu modelde PD’nin farmakolojik etkilerini ve altta yatan mekanizmalarını daha fazla incelemek için kullanılmıştır.
Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) terimi, basit steatoz, NASH, siroz ve hepatosellüler karsinom11’i içeren bir grup karaciğer hastalığını ifade eder. NAFLD’nin patogenezi tam olarak anlaşılamamış olsa da, klasik “iki isabetli” teoriden mevcut “çoklu vuruş” teorisine kadar, insülin direncinin NAFLD patogenezinde merkezi olduğu düşünülmektedir12,13,14. Çalışmalar, hepatositlerdeki insülin direncinin, karaciğerde biriken trigliseritleri oluşturan ve karaciğerin yağlı olmasına neden olan serbest yağ asitlerinin artmasına neden olabileceğini göstermiştir15,16. Yağ birikimi lipotoksisiteye, oksidatif strese bağlı mitokondriyal disfonksiyona, endoplazmik retikulum stresine ve inflamatuar sitokin salınımına yol açarak NAFLD17,18’in patogenezine ve ilerlemesine neden olabilir. Ek olarak, otofaji, hücresel insülin duyarlılığını, hücresel lipid metabolizmasını, hepatosit hasarını ve doğuştan gelen bağışıklığı düzenlemede rol oynadığı için NAFLD’nin patogenezinde de rol oynar 19,20,21.
NAFLD22,23’ün patogenezini ve potansiyel terapötik hedeflerini araştırmak için bir temel oluşturmak üzere çeşitli hayvan modelleri ve hücresel modeller oluşturulmuştur. Bununla birlikte, tek hayvan modelleri NAFLD24’ün tüm patolojik süreçlerini tam olarak taklit edemez. Hayvanlar arasındaki bireysel farklılıklar farklı patolojik özelliklere yol açar. NAFLD’nin in vitro çalışmalarında karaciğer hücre hatlarının veya primer hepatositlerin kullanılması, deneysel koşullarda maksimum tutarlılık sağlar. Hepatik lipid metabolizması disregülasyonu, NAFLD25’te daha yüksek seviyelerde hepatosit lipid damlacık birikimine yol açabilir. Oleik asit ve palmiye yağı gibi serbest yağ asitleri, in vitro modelde, yüksek yağlı bir diyetin neden olduğu NAFLD’yi taklit etmek için kullanılmıştır26,27. İnsan hepatoblastoma hücre hattı HepG2, in vitro NAFLD modellerinin yapımında sıklıkla kullanılır, ancak bir tümör hücre hattı olarak, HepG2 hücrelerinin metabolizması normal fizyolojik koşullar altında karaciğer hücrelerininkinden önemli ölçüde farklıdır28. Bu nedenle, ilaç taraması için in vitro NAFLD modelini oluşturmak için primer hepatositleri veya fare primer hepatositlerini kullanmak, tümör hücre hatlarını kullanmaktan daha avantajlıdır. Hem hayvan modellerinde hem de in vitro hepatosit modellerinde ilaç etkilerinin ve terapötik hedeflerin sinerjik incelemesi karşılaştırıldığında, in vitro NAFLD modelini oluşturmak için fare hepatositlerinin kullanılmasının daha iyi uygulama potansiyeline sahip olduğu görülmektedir.
Karaciğere giren serbest yağ asitleri enerji üretmek için oksitlenir veya trigliseritler olarak depolanır. Önemli ölçüde, serbest yağ asitleri belirli bir lipotoksisiteye sahiptir ve hücresel disfonksiyon ve apoptozu indükleyebilir12. Palmitik asit (PA), insan plazmasında en bol bulunan doymuş yağ asididir29. Yağ dışı dokudaki hücreler uzun süre yüksek konsantrasyonlarda PA’ya maruz kaldığında, bu reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini uyarır ve oksidatif strese, lipit birikimine ve hatta apoptoza neden olur30. Bu nedenle, birçok araştırmacı PA’yı karaciğer hücrelerini ROS üretmeye teşvik etmek için bir indükleyici olarak kullanır ve böylece in vitro yağlı karaciğer hastalığı modelini oluşturur ve bazı aktif maddelerin hücreler üzerindeki koruyucu etkilerini değerlendirir31,32,33,34. Bu çalışma, PD’nin PA tarafından indüklenen NAFLD’nin bir hücre modeli üzerindeki koruyucu etkilerini araştırmak için bir protokol sunmaktadır.
Çalışmalar, NAFLD’nin yağlı karaciğerden NASH’ye kadar değişen, siroz ve karaciğer kanserine ilerleyebilen klinikopatolojik bir sendrom olduğu gerçeğini vurgulamıştır51. Yüksek yağlı bir diyet ve aktif olmayan bir yaşam tarzı NAFLD için tipik risk faktörleridir. NAFLD tedavisi için hem ilaç dışı tedaviler hem de ilaç tedavileriaraştırılmıştır 51,52,53. Bununla birlikte, N…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Chongqing Bilim ve Teknoloji Komisyonu (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 ve jbky20210029) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (No. 2021MD703919) tarafından desteklenmektedir.
5% BSA Blocking Buffer | Solarbio, Beijing, China | SW3015 | |
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line | Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China | AML12 | |
Beyo ECL Plus | Beyotime, Shanghai, China | P0018S | |
Bio-safety cabinet | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | AC2-5S1 A2 | |
cellSens | Olympus, Tokyo, Japan | 1.8 | |
Culture CO2 Incubator | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | CCL-170B-8 | |
Dexamethasone | Beyotime, Shanghai, China | ST125 | |
Dimethyl sulfoxide | Solarbio, Beijing, China | D8371 | |
DMEM/F12 | Hyclone, Logan, UT, USA | SH30023.01 | |
Foetal Bovine Serum | Hyclone, Tauranga, New Zealand | SH30406.05 | |
Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 8.0 | |
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | ABclonal, Wuhan, China | AS003 | |
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane | Merck, Darmstadt, Germany | IPFL00010 | |
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× | Beyotime, Shanghai, China | C0341 | |
MAP LC3β Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-376404 | |
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 | Solarbio, Beijing, China | M8650 | |
Olympus Inverted Microscope IX53 | Olympus, Tokyo, Japan | IX53 | |
Palmitic Acid | Sigma, Germany | P0500 | |
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | Hyclone, Logan, UT, USA | SV30010 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Beyotime, Shanghai, China | ST506 | |
Phosphate Buffered Solution | Hyclone, Logan, UT, USA | BL302A | |
Platycodin D | Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China | CSA: 58479-68-8 | |
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x | Beyotime, Shanghai, China | P1005 | |
Protein Marker | Solarbio, Beijing, China | PR1910 | |
Reactive Oxygen Species Assay Kit | Solarbio, Beijing, China | CA1410 | |
RIPA Lysis Buffer | Beyotime, Shanghai, China | P0013E | |
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit | Beyotime, Shanghai, China | P0012AC | |
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x | Beyotime, Shanghai, China | P0015 | |
Sigma Centrifuge | Sigma, Germany | 3K15 | |
SQSTM1/p62 Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-28359 | |
Tecan Infinite 200 PRO | Tecan Austria GmbH, Austria | 1510002987 | |
WB Transfer Buffer,10x | Solarbio, Beijing, China | D1060 | |
β-Actin Mouse mAb | ABclonal, Wuhan, China | AC004 |