Untersuchung der protektiven Wirkung von Platycodin D auf die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung in einem Palmitinsäure-induzierten In-vitro-Modell

Summary

Dieses Protokoll untersucht die protektive Wirkung von Platycodin D auf die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung in einem Palmitinsäure-induzierten In-vitro-Modell .

Abstract

Das Auftreten der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) hat weltweit alarmierend zugenommen. Platycodon grandiflorum wird häufig als traditionelle Ethnomedizin zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt und ist ein typisches funktionelles Lebensmittel, das in die tägliche Ernährung integriert werden kann. Studien deuten darauf hin, dass Platycodin D (PD), einer der Hauptwirkstoffe in Platycodon grandiflorum, eine hohe Bioverfügbarkeit aufweist und das Fortschreiten der NAFLD signifikant abschwächt, aber der zugrunde liegende Mechanismus ist noch unklar. Ziel dieser Studie ist es, die therapeutische Wirkung von Parkinson gegen NAFLD in vitro zu untersuchen. AML-12-Zellen wurden mit 300 μM Palmitinsäure (PA) für 24 h vorbehandelt, um NAFLD in vitro zu modellieren. Dann wurden die Zellen entweder mit Parkinson behandelt oder erhielten 24 Stunden lang keine Parkinson-Behandlung. Die Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wurden mittels 2′,7′-Dichlor-Dihydro-Fluorescein-Diacetat (DCFH-DA)-Färbung analysiert, und das mitochondriale Membranpotential wurde durch die JC-1-Färbemethode bestimmt. Darüber hinaus wurden die Proteinexpressionsniveaus von LC3-II/LC3-I und p62/SQSTM1 in den Zelllysaten mittels Western Blot analysiert. Es wurde festgestellt, dass Parkinson die ROS- und Mitochondrienmembranpotentialspiegel in der PA-behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verringert. Währenddessen erhöhte die Parkinson-Krankheit die LC3-II/LC3-I-Spiegel und senkte die p62/SQSTM1-Spiegel in der PA-behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Ergebnisse zeigten, dass Parkinson die NAFLD in vitro verbesserte, indem es oxidativen Stress reduzierte und die Autophagie stimulierte. Dieses In-vitro-Modell ist ein nützliches Werkzeug, um die Rolle von Parkinson bei NAFLD zu untersuchen.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), die getrocknete Wurzel von Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., wird in der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) verwendet. Es wird hauptsächlich in den nordöstlichen, nördlichen, östlichen, zentralen und südwestlichen Regionen Chinas^{produziert 1}. Zu den PG-Komponenten gehören Triterpenoid-Saponine, Polysaccharide, Flavonoide, Polyphenole, Polyethylenglykole, ätherische Öle und Mineralien². PG hat eine lange Geschichte der Verwendung als Lebensmittel und Kräutermedizin in Asien. Traditionell wurde dieses Kraut zur Herstellung von Medikamenten gegen Lungenkrankheiten verwendet. Die moderne Pharmakologie liefert auch Hinweise auf die Wirksamkeit von PG bei der Behandlung anderer Krankheiten. Studien haben gezeigt, dass PG eine therapeutische Wirkung auf eine Vielzahl von medikamenteninduzierten Leberschädigungsmodellen hat. Die Nahrungsergänzung mit PG- oder Platycodin-Extrakten kann fettreiche, ernährungsbedingte Fettleibigkeit und die damit verbundenen Stoffwechselerkrankungen lindern ^3,4,5. Polysaccharide aus PG können zur Behandlung von akuten Leberschäden verwendet werden, die durch LPS/D-GalN bei Mäusen verursacht werden⁶. Darüber hinaus verbessern Saponine aus den Wurzeln von PG die fettreiche, diätinduzierte nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH)⁷. Darüber hinaus kann Platycodin D (PD), eine der wichtigsten therapeutischen Komponenten von PG, die Expression von Lipoproteinrezeptoren niedriger Dichte und die Aufnahme von Lipoproteinen niedriger Dichte in humanen hepatozellulären Karzinomzellen (HepG2) verbessern⁸. Darüber hinaus kann Parkinson auch Apoptose induzieren und Adhäsion, Migration und Invasion in HepG2-Zellen hemmen ^9,10. Daher werden in dieser Studie Hepatoma-AML-12-Zellen der Maus für die In-vitro-Modellkonstruktion und zur weiteren Untersuchung der pharmakologischen Wirkungen und der zugrunde liegenden Mechanismen der Parkinson-Krankheit in diesem Modell verwendet.

Der Begriff nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) bezieht sich auf eine Gruppe von Lebererkrankungen, zu denen einfache Steatose, NASH, Zirrhose und hepatozelluläres Karzinom^{gehören 11}. Obwohl die Pathogenese der NAFLD von der klassischen “Two-Hit”-Theorie bis zur aktuellen “Multiple-Hit”-Theorie unvollständig verstanden ist, wird die Insulinresistenz als zentral für die Pathogenese der NAFLD^{angesehen 12,13,14}. Studien haben gezeigt, dass eine Insulinresistenz in Hepatozyten zu einem erhöhten Anteil an freien Fettsäuren führen kann, die Triglyceride bilden, die sich in der Leber ablagern und dazu führen, dass die Leber fett wird^15,16. Die Ansammlung von Fett kann zu Lipotoxizität, oxidativem Stress induzierter mitochondrialer Dysfunktion, endoplasmatischem Retikulumstress und entzündlicher Zytokinfreisetzung führen, was zur Pathogenese und Progression von NAFLD^17,18 führt. Darüber hinaus spielt die Autophagie auch eine Rolle bei der Pathogenese der NAFLD, da sie an der Regulierung der zellulären Insulinsensitivität, des zellulären Fettstoffwechsels, der Hepatozytenschädigung und der angeborenen Immunität beteiligt ist 19,20,21.

Eine Vielzahl von Tiermodellen und zellulären Modellen wurde etabliert, um eine Grundlage für die Erforschung der Pathogenese und potenzieller therapeutischer Ziele von NAFLD^22,23 zu schaffen. Einzeltiermodelle können jedoch nicht alle pathologischen Prozesse von NAFLD²⁴ vollständig nachahmen. Individuelle Unterschiede zwischen Tieren führen zu unterschiedlichen pathologischen Merkmalen. Die Verwendung von Leberzelllinien oder primären Hepatozyten in In-vitro-Studien der NAFLD gewährleistet eine maximale Konsistenz unter den experimentellen Bedingungen. Eine Dysregulation des hepatischen Lipidstoffwechsels kann bei NAFLD²⁵ zu einer höheren Akkumulation von Hepatozyten-Lipidtröpfchen führen. Freie Fettsäuren wie Ölsäure und Palmöl wurden im In-vitro-Modell verwendet, um NAFLD nachzuahmen, die durch eine fettreiche Ernährung verursacht wurde^26,27. Die humane Hepatoblastom-Zelllinie HepG2 wird häufig bei der Konstruktion von NAFLD-Modellen in vitro verwendet, aber als Tumorzelllinie unterscheidet sich der Metabolismus von HepG2-Zellen signifikant von dem von Leberzellen unter normalen physiologischen Bedingungen²⁸. Daher ist die Verwendung von primären Hepatozyten oder primären Hepatozyten der Maus zur Konstruktion des In-vitro-NAFLD-Modells für das Wirkstoffscreening vorteilhafter als die Verwendung von Tumorzelllinien. Vergleicht man die synergistische Untersuchung von Arzneimittelwirkungen und therapeutischen Zielen sowohl in Tiermodellen als auch in vitro-Hepatozytenmodellen, so scheint es, dass die Verwendung von Maushepatozyten zur Konstruktion des In-vitro-NAFLD-Modells ein besseres Anwendungspotenzial hat.

Freie Fettsäuren, die in die Leber gelangen, werden zur Energiegewinnung oxidiert oder als Triglyceride gespeichert. Bezeichnenderweise weisen freie Fettsäuren eine gewisse Fettotoxizität auf und können zelluläre Funktionsstörungen und Apoptose induzieren¹². Palmitinsäure (PA) ist die am häufigsten vorkommende gesättigte Fettsäure im menschlichen Plasma²⁹. Wenn Zellen in nicht-adipösem Gewebe über einen längeren Zeitraum hohen Konzentrationen von PA ausgesetzt sind, stimuliert dies die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und verursacht oxidativen Stress, Lipidakkumulation und sogar Apoptose³⁰. Daher verwenden viele Forscher PA als Induktor, um Leberzellen zur Produktion von ROS anzuregen und so das In-vitro-Modell der Fettlebererkrankung zu konstruieren und die schützende Wirkung bestimmter Wirkstoffe auf Zellen zu bewerten^31,32,33,34. Diese Studie stellt ein Protokoll zur Untersuchung der protektiven Wirkungen von Parkinson auf ein Zellmodell von NAFLD vor, das durch PA induziert wird.

Protocol

AML-12-Zellen (eine normale Hepatozyten-Zelllinie der Maus) werden für die zellbasierten Studien verwendet. Die Zellen werden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle). 1. Vorbehandlung der AML-12-Zellen zur Modellierung der NAFLD in vitro Halten Sie die Zellen in normalen Zellkulturmedien (DMEM plus Ham’s F12 [1:1] mit 0,005 mg/ml Insulin, 5 ng/ml Selen, 0,005 mg/ml Transferrin, 40 ng/ml Dexamethason und 10 % fötalem…

Representative Results

Intrazelluläre ROS in den ZellenAML-12-Zellen wurden mit 300 μM PA für 24 h induziert und ein NAFLD-Zellmodell wurde etabliert. Anschließend wurden die Zellen 24 h lang mit Parkinson behandelt. Die Zellen wurden mit einer DCFH-DA-Fluoreszenzsonde markiert und die ROS-Produktion wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die Ergebnisse der DCFH-DA-Färbung von intrazellulärem ROS in den Zellen sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass Park…

Discussion

Studien haben die Tatsache hervorgehoben, dass NAFLD ein klinisch-pathologisches Syndrom ist, das von Fettleber bis NASH reicht und zu Leberzirrhose und Leberkrebs führen kann⁵¹. Eine fettreiche Ernährung und ein inaktiver Lebensstil sind typische Risikofaktoren für NAFLD. Sowohl nicht-medikamentöse Therapien als auch medikamentöse Therapien zur NAFLD-Behandlung wurden erforscht 51,52,53. Die Pathoge…

Materials

5% BSA Blocking Buffer	Solarbio, Beijing, China	SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line	Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China	AML12
Beyo ECL Plus	Beyotime, Shanghai, China	P0018S
Bio-safety cabinet	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	AC2-5S1 A2
cellSens	Olympus, Tokyo, Japan	1.8
Culture CO2 Incubator	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	CCL-170B-8
Dexamethasone	Beyotime, Shanghai, China	ST125
Dimethyl sulfoxide	Solarbio, Beijing, China	D8371
DMEM/F12	Hyclone, Logan, UT, USA	SH30023.01
Foetal Bovine Serum	Hyclone, Tauranga, New Zealand	SH30406.05
Graphpad software	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	ABclonal, Wuhan, China	AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane	Merck, Darmstadt, Germany	IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×	Beyotime, Shanghai, China	C0341
MAP LC3β Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1	Solarbio, Beijing, China	M8650
Olympus Inverted Microscope IX53	Olympus, Tokyo, Japan	IX53
Palmitic Acid	Sigma, Germany	P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	Hyclone, Logan, UT, USA	SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Beyotime, Shanghai, China	ST506
Phosphate Buffered Solution	Hyclone, Logan, UT, USA	BL302A
Platycodin D	Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China	CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x	Beyotime, Shanghai, China	P1005
Protein Marker	Solarbio, Beijing, China	PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit	Solarbio, Beijing, China	CA1410
RIPA Lysis Buffer	Beyotime, Shanghai, China	P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit	Beyotime, Shanghai, China	P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Beyotime, Shanghai, China	P0015
Sigma Centrifuge	Sigma, Germany	3K15
SQSTM1/p62 Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO	Tecan Austria GmbH, Austria	1510002987
WB Transfer Buffer,10x	Solarbio, Beijing, China	D1060
β-Actin Mouse mAb	ABclonal, Wuhan, China	AC004