In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions radiculaires dorsaux intacts
Summary
Ce protocole décrit l’exposition chirurgicale du ganglion radiculaire dorsal (DRG) suivi de GCaMP3 (indicateur Ca2+ codé génétiquement; Protéine fluorescente verte-calmoduline-protéine M13 3) Imagerie Ca2+ des ensembles neuronaux à l’aide de souris Pirt-GCaMP3 tout en appliquant une variété de stimuli à la patte postérieure ipsilatérale.
Abstract
L’imagerie Ca 2+ peut être utilisée comme proxy de l’activité cellulaire, y compris les potentiels d’action et divers mécanismes de signalisation impliquant l’entrée de Ca 2+ dans le cytoplasme ou la libération de réserves intracellulaires de Ca2+. L’imagerie Ca2+ basée sur Pirt-GCaMP3 des neurones sensoriels primaires du ganglion de la racine dorsale (DRG) chez la souris offre l’avantage de mesurer simultanément un grand nombre de cellules. Jusqu’à 1 800 neurones peuvent être surveillés, ce qui permet d’étudier les réseaux neuronaux et les processus somatosensoriels en tant qu’ensemble dans leur contexte physiologique normal au niveau de la population in vivo. Le grand nombre de neurones surveillés permet de détecter des schémas d’activité qui seraient difficiles à détecter en utilisant d’autres méthodes. Les stimuli peuvent être appliqués à la patte postérieure de la souris, ce qui permet d’étudier les effets directs des stimuli sur l’ensemble neuronal DRG. Le nombre de neurones produisant des transitoires Ca 2+ ainsi que l’amplitude des transitoires Ca2+ indiquent une sensibilité à des modalités sensorielles spécifiques. Le diamètre des neurones fournit des preuves de types de fibres activées (mécano non nocif vs fibres nocives de la douleur, fibres Aβ, Aδ et C). Les neurones exprimant des récepteurs spécifiques peuvent être marqués génétiquement avec la tomate td-tomate et des recombinases Cre spécifiques avec Pirt-GCaMP. Par conséquent, l’imagerie Pirt-GCaMP3 Ca2+ de DRG fournit un outil et un modèle puissants pour l’analyse de modalités sensorielles spécifiques et de sous-types de neurones agissant comme un ensemble au niveau de la population pour étudier la douleur, les démangeaisons, le toucher et d’autres signaux somatosensoriels.
Introduction
Les neurones sensoriels primaires innervent directement la peau et ramènent l’information somatosensorielle au système nerveux central 1,2. Les ganglions radiculaires dorsaux (DRG) sont des amas cellulaires de 10 000 à 15 000 neurones sensoriels primaires 3,4. Les neurones DRG présentent divers modèles d’expression de taille, de myélinisation et de gènes et de récepteurs. Les neurones de plus petit diamètre comprennent les neurones sensibles à la douleur et les neurones de plus grand diamètre répondent généralement à des stimuli mécaniques non douloureux 5,6. Les troubles des neurones sensoriels primaires tels que les blessures, l’inflammation chronique et les neuropathies périphériques peuvent sensibiliser ces neurones à divers stimuli et contribuer à la douleur chronique, à l’allodynie et à l’hypersensibilité à la douleur 7,8. Par conséquent, l’étude des neurones DRG est importante pour comprendre à la fois la somatosensation en général et de nombreux troubles de la douleur et des démangeaisons.
Les neurones qui tirent in vivo sont essentiels à la somatosensation, mais jusqu’à récemment, les outils permettant d’étudier in vivo les ganglions intacts étaient limités à un nombre relativement restreint de cellules9. Ici, nous décrivons une méthode puissante pour étudier les potentiels d’action ou les activités des neurones au niveau de la population in vivo en tant qu’ensemble. La méthode utilise l’imagerie basée sur la dynamique cytoplasmique Ca2+. Les indicateurs fluorescents sensibles au Ca 2+ sont de bons indicateurs pour mesurer l’activité cellulaire en raison de la concentration normalement faible de Ca2+ cytoplasmique. Ces indicateurs ont permis de surveiller simultanément des centaines à plusieurs milliers de neurones sensoriels primaires chez les souris 9,10,11,12,13,14,15,16 et les rats17. La méthode d’imagerie Ca2+ in vivo décrite dans cette étude peut être utilisée pour observer directement les réponses au niveau de la population aux stimuli mécaniques, froids, thermiques et chimiques.
La protéine membranaire liant le phosphoinositide, Pirt, est exprimée à des niveaux élevés dans presque tous les neurones sensoriels primaires (>95%)18,19 et peut être utilisée pour piloter l’expression du capteur Ca 2+, GCaMP3, pour surveiller l’activité des neurones in vivo20. Dans ce protocole, des techniques sont décrites pour effectuer une chirurgie DRG in vivo, une imagerie Ca2+ et une analyse dans le DRG lombaire 5 (L5) droit de souris Pirt-GCaMP314 à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser (LSM).
Protocol
Representative Results
Discussion
La douleur persistante est présente dans un large éventail de troubles, débilitante et/ou réduisant la qualité de vie d’environ 8% des personnes29. Les neurones sensoriels primaires détectent les stimuli nocifs sur la peau, et leur plasticité contribue à la persistance de la douleur8. Bien que les neurones puissent être étudiés en culture cellulaire et explants, cela les éloigne de leur contexte physiologique normal. L’exposition chirurgicale du DRG, suivie …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions R01DE026677 et R01DE031477 des National Institutes of Health (à Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) et un prix Rising STAR du système de l’Université du Texas (Y.S.K.).
Materials
| Anased Injection (Xylazine) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
| C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC | Cal Zeiss | 422642-9900-000 | |
| Cotton Tipped Applicators | McKesson | 24-106-1S | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| DC Temperature Controller Heating Pad | FHC | 40-90-2-05 | |
| Dumont Ceramic Coated Forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| FHC DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fluriso (Isoflurane) | MWI Animal Health, Piramal Group | 501017 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| GelFoam | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Ketaset (Ketamine) | Zoetis | KET-00002R2 | |
| Luminescent Green Stage Tape | JSITON/ Amazon | B803YW8ZWL | |
| Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer | Midmark | 91305430 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Micro dissecting spring scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5677 | |
| Mini Rectal Thermistor Probe | FHC | 40-90-5D-02 | |
| Operating scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice | Johns Hopkins University | N/A | Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice. |
| SMALGO small animal algometer | Bioseb In vivo Research Instruments | BIO-SMALGO | |
| Stereotaxic frame | Kopf Model 923-B | 923-B | |
| td-Tomato C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 7909 | |
| Top Plate, 6 in x 10 in | Newport | 290-TP | |
| TrpV1-Cre C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 17769 | |
| Zeiss LSM 800 confocal microscope | Cal Zeiss | LSM800 | |
| Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software | Cal Zeiss | Zen (Blue Edition) 2.6 |
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