Denna artikel beskriver protokoll för gelatinmetakrylylmikrogeltillverkning med hög genomströmning med hjälp av mikrofluidiska anordningar, omvandling av mikrogeler till resuspenderbart pulver (mikroaerogeler), kemisk sammansättning av mikrogeler för att bilda granulära hydrogelställningar och utveckling av granulära hydrogelbiobläck med bevarad mikroporositet för 3D-bioprinting.
Framväxten av granulära hydrogelställningar (GHS), tillverkade via montering av hydrogelmikropartiklar (HMP), har möjliggjort mikroporös ställningsbildning in situ. Till skillnad från konventionella bulkhydrogeler underlättar sammankopplade porer i mikroskala i GHS nedbrytningsoberoende cellinfiltration samt överföring av syre, näringsämnen och cellulära biprodukter. Metaakryloylmodifierat gelatin (GelMA), en (foto) kemiskt tvärbindningsbar, proteinbaserad biopolymer innehållande celllim och biologiskt nedbrytbara delar, har i stor utsträckning använts som ett cellresponsivt / instruktivt biomaterial. Konvertering av bulk GelMA till GHS kan öppna en uppsjö av möjligheter för vävnadsteknik och regenerering. I den här artikeln demonstrerar vi procedurerna för GelMA-mikrogeltillverkning med hög kapacitet, omvandling till resuspenderbara torra mikrogeler (mikroaerogeler), GHS-bildning via kemisk montering av mikrogeler och granulär biobläcktillverkning för extruderingsbioprinting. Vi visar hur en sekventiell fysikalisk-kemisk behandling via kylning och fototvärbindning möjliggör bildandet av mekaniskt robust GHS. När ljus är otillgängligt (t.ex. under djup vävnadsinjektion) kan individuellt tvärbundna GelMA HMP monteras bioortogonalt via enzymatisk tvärbindning med användning av transglutaminaser. Slutligen demonstreras tredimensionell (3D) bioprinting av mikroporös GHS vid låg HMP-packningstäthet via gränssnittssjälvmontering av heterogent laddade nanopartiklar.
Montering av HMP-byggstenar för att bilda vävnadstekniska byggnadsställningar har fått enorm uppmärksamhet under de senaste åren1. GHS, tillverkad via HMP-montering, har unika egenskaper jämfört med sina bulkmotsvarigheter, inklusive mikroporositet i cellskala som härrör från tomrummen bland de diskreta byggstenarna. Ytterligare egenskaper, såsom injicerbarhet, modularitet och frikopplad styvhet från porositet, gör GHS till en lovande plattform för att förbättra vävnadsreparation och regenerering2. Olika biomaterial har använts för GHS-tillverkning, inklusive syntetiska PEG-baserade polymerer3,4 och polysackarider, såsom alginat5 och hyaluronsyra 6,7. Bland naturligt framställda polymerer är den vanligaste proteinbaserade biopolymeren för GHS-tillverkning GelMA 8,9,10,11, ett tvärbindningsbart, biokompatibelt, bioadhesivt och biologiskt nedbrytbart biomaterial 12,13.
HMP kan tillverkas via batchemulgering8, flödesfokusering 14,15 eller stegemulgering9,11 mikrofluidiska anordningar, blandning 16, eller komplex koacervation17,18. Vanligtvis finns det en avvägning mellan tillverkningsgenomströmningen och HMP-monodispersiteten. Till exempel ger blandningstekniken oregelbundet formade och mycket polydispergerade HMP. Batchemulgering eller komplex koacervation möjliggör produktion av stora volymer polydispergerade sfäriska HMP. Flödesfokuserande mikrofluidiska enheter har använts för att tillverka mycket monodispersa droppar med en variationskoefficient på <5%, men genomströmningen är signifikant låg. I mikrofluidiska enheter med stegemulgering möjliggör de mycket parallelliserade stegen tillverkning med hög genomströmning av monodispergerade HMP19.
Metakrylmodifierat gelatin (GelMA) HMP-byggstenar är termoresponsiva och (foto)kemiskt tvärbindningsbara, vilket möjliggör enkel GHS-tillverkning20. Vid kylning under den övre kritiska lösningstemperaturen (UCST)21 (t.ex. vid 4 °C) omvandlas droppar som innehåller en GelMA-lösning till fysiskt tvärbundna HMP. Dessa HMP-byggstenar packas sedan med hjälp av externa krafter (t.ex. via centrifugering) för att ge fastnat mikrogelsuspensioner. Interpartikelbindningar upprättas mellan intilliggande HMP via (foto)kemisk tvärbindning för att bilda mekaniskt robust GHS14. En av de viktigaste egenskaperna hos GHS är mikroporositet, vilket möjliggör enkel cellpenetration in vitro11 och förbättrad vävnadsinväxt in vivo22. Tredimensionell (3D) bioprinting av HMP utförs konventionellt med tätt packade mikrogelsuspensioner, vilket äventyrar mikroporositeten23.
Vi har nyligen utvecklat en ny klass av granulära biobläck baserade på gränssnittsnanoengineering av GelMA-mikrogeler via adsorption av heterogent laddade nanopartiklar, följt av nanopartikelreversibel självmontering. Denna strategi gör löst packade mikrogeler skjuvavkastande och extrudering 3D bioprintbar, vilket bevarar mikroskala porositeten hos additivt tillverkade GHS11. Denna artikel presenterar metoderna för tillverkning av GelMA-droppar med hög genomströmning, omvandling av dessa droppar till fysiskt tvärbundna HMP, tillverkning av GelMA HMP med resuspenderbart pulver, GelMA GHS-bildning, GelMA nanoengineered granulärt biobläckpreparat (NGB) och 3D-bioprinting.
Gelatin och dess derivat är de vanligaste proteinbaserade biomaterialen för HMP-tillverkning. Utmaningen med genomströmning kontra monodispersitetsavvägning av partikelstorlek kan övervinnas med hjälp av stegemulgerande mikrofluidiska enheter. Dessa enheter kan bilda mer än 40 miljoner droppar per timme, med en variationskoefficient mindre än 5%27. I den här artikeln diskuterade vi mikrofabrikation av droppar som innehåller GelMA-lösningar, följt av att konvertera dem till GelMA HMP, p…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka T. Pond, forskningsstödsspecialist vid Institutionen för kemiteknik vid Pennsylvania State University (Penn State), Nanofabrication Lab-personalen vid Penn State och Dr. J. de Rutte från Partillion Bioscience för hjälp och diskussion om nanofabrikationsprocesser. A. Sheikhi erkänner stödet från Materials Research Institute (MRI) och College of Engineering Materials Matter på Human Level fröbidrag, Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) och Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program och startfonden från Penn State. Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes delvis av National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) vid National Institutes of Health (NIH) under tilldelningsnummer R56EB032672.
1H,1H-perfluoro-1-octanol | Alfa Aesar, MA, USA | B20156-18 | 98% purity |
Biopsy punch | Integra Miltex, NY, USA | 33-31A-P/25 | 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System |
Blunt needle | SANANTS | 30-002-25 | 25 G |
Bruker Avance NEO 400 MHz | 400 MHz Bruker NEO, MA, USA | NMR device | |
Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5415 C | |
Centrifuge tube | Celltreat, MA ,USA | 229423 | |
Coffee filters | BUNN, IL, USA | 20104.0006 | BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct |
Desiccator | Thermo Scientific | 5311-0250 | Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD |
Deuterium oxide | Sigma, MA, USA | 151882 | |
Dialysis membrane (12-14 kDa) | Spectrum Laboratories, NJ, USA | 08-667E | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) | Sigma, MA, USA | 56064C-10L | dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture |
Erlenmeyer flask | Corning, NY, USA | 4980 | Corning PYREX |
Ethanol | VWR, PA, USA | 89125-188 | Koptec 200 proof |
External thread cryogenic vials (cryovials) | Corning, NY, USA | 430659 | |
Freeze dryer | Labconco, MO, USA | 71042000 | Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000) |
Gelatin powder | Sigma, MA, USA | G1890-5100G | Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom |
Glass microscope slides | VWR, PA, USA | 82027-788 | |
Hotplate | FOUR E'S SCIENTIFIC | MI0102003 | 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F |
Kimwipes | Fischer scientific, MA, USA | 06-666 | |
KMPR 1000 negative photoresist series | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | 121619 | KMPR1025 and KMP1035 are included |
LAPONITE XLG | BYK USA Inc., CT, USA | 2344265 | |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma, MA, USA | 900889-1G | >95% |
Luer-Lok connector | BD, NJ, USA | BD 302995 | |
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner | SÜSS MicroTeck, German | Nanofabrication device | |
Methacylate anhydride | Sigma, MA, USA | 276685-100ML | contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94% |
Milli-Q water | Millipore Corporation, MA, USA | ZRQSVR5WW | electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System |
Novec 7500 engineering fluid | 3M, MN, USA | 3M ID 7100003723 | |
Oven | VWR, PA, USA | VWR-1410 | 1410 Vacuum Oven |
Parafilm | Fischer scientific, MA, USA | HS234526C | |
Pasteur pipette | VWR, PA, USA | 14673-010 | |
Petri dish | VWR, PA, USA | 25384-092 | polystyrene |
Pico-Surf | Sphere Fluidics, UK | C022 | (5% (w/w) in Novec 7500) |
Pipette | VWR, PA, USA | 89079-970 | |
Pipette tips | VWR, PA, USA | 87006-060 | |
Plasma cleaner chamber | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-001-HP | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning, MI, USA | 2065623 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
Positive displacement pipette | Microman E M100E, Gilson, OH, USA | M100E | |
Silicon wafers | UniversityWafer, MA, USA | 452/1196 | 4-inch mechanical grade |
Spatula | VWR, PA, USA | 231-0104 | Disposable |
SU-8 | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | ||
Syringe pump | Harvard Apparatus, MA, USA | 70-2001 | PHD 2000 |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Millipore Sigma, MA, USA | 448931-10G | 97% |
Tygon tubings | Saint-globain, PA, USA | AAD04103 | |
UV light | QUANS | Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W | |
Vacuum filtration unit | VWR, PA, USA | 10040-460 | 0.20 µm |
Vortex | Fischer scientific, USA | 14-955-151 | Mini Vortex Mixer |