Gelatinmetakryloylgranulära hydrogelställningar: Mikrogeltillverkning med hög genomströmning, frystorkning, kemisk montering och 3D-bioprinting

Summary

Denna artikel beskriver protokoll för gelatinmetakrylylmikrogeltillverkning med hög genomströmning med hjälp av mikrofluidiska anordningar, omvandling av mikrogeler till resuspenderbart pulver (mikroaerogeler), kemisk sammansättning av mikrogeler för att bilda granulära hydrogelställningar och utveckling av granulära hydrogelbiobläck med bevarad mikroporositet för 3D-bioprinting.

Abstract

Framväxten av granulära hydrogelställningar (GHS), tillverkade via montering av hydrogelmikropartiklar (HMP), har möjliggjort mikroporös ställningsbildning in situ. Till skillnad från konventionella bulkhydrogeler underlättar sammankopplade porer i mikroskala i GHS nedbrytningsoberoende cellinfiltration samt överföring av syre, näringsämnen och cellulära biprodukter. Metaakryloylmodifierat gelatin (GelMA), en (foto) kemiskt tvärbindningsbar, proteinbaserad biopolymer innehållande celllim och biologiskt nedbrytbara delar, har i stor utsträckning använts som ett cellresponsivt / instruktivt biomaterial. Konvertering av bulk GelMA till GHS kan öppna en uppsjö av möjligheter för vävnadsteknik och regenerering. I den här artikeln demonstrerar vi procedurerna för GelMA-mikrogeltillverkning med hög kapacitet, omvandling till resuspenderbara torra mikrogeler (mikroaerogeler), GHS-bildning via kemisk montering av mikrogeler och granulär biobläcktillverkning för extruderingsbioprinting. Vi visar hur en sekventiell fysikalisk-kemisk behandling via kylning och fototvärbindning möjliggör bildandet av mekaniskt robust GHS. När ljus är otillgängligt (t.ex. under djup vävnadsinjektion) kan individuellt tvärbundna GelMA HMP monteras bioortogonalt via enzymatisk tvärbindning med användning av transglutaminaser. Slutligen demonstreras tredimensionell (3D) bioprinting av mikroporös GHS vid låg HMP-packningstäthet via gränssnittssjälvmontering av heterogent laddade nanopartiklar.

Introduction

Montering av HMP-byggstenar för att bilda vävnadstekniska byggnadsställningar har fått enorm uppmärksamhet under de senaste åren¹. GHS, tillverkad via HMP-montering, har unika egenskaper jämfört med sina bulkmotsvarigheter, inklusive mikroporositet i cellskala som härrör från tomrummen bland de diskreta byggstenarna. Ytterligare egenskaper, såsom injicerbarhet, modularitet och frikopplad styvhet från porositet, gör GHS till en lovande plattform för att förbättra vävnadsreparation och regenerering². Olika biomaterial har använts för GHS-tillverkning, inklusive syntetiska PEG-baserade polymerer^3,4 och polysackarider, såsom alginat⁵ och hyaluronsyra ^6,7. Bland naturligt framställda polymerer är den vanligaste proteinbaserade biopolymeren för GHS-tillverkning GelMA 8,9,10,11, ett tvärbindningsbart, biokompatibelt, bioadhesivt och biologiskt nedbrytbart biomaterial ^12,13.

HMP kan tillverkas via batchemulgering⁸, flödesfokusering 14,15 eller stegemulgering^9,11 mikrofluidiska anordningar, blandning 16, eller komplex koacervation^17,18. Vanligtvis finns det en avvägning mellan tillverkningsgenomströmningen och HMP-monodispersiteten. Till exempel ger blandningstekniken oregelbundet formade och mycket polydispergerade HMP. Batchemulgering eller komplex koacervation möjliggör produktion av stora volymer polydispergerade sfäriska HMP. Flödesfokuserande mikrofluidiska enheter har använts för att tillverka mycket monodispersa droppar med en variationskoefficient på <5%, men genomströmningen är signifikant låg. I mikrofluidiska enheter med stegemulgering möjliggör de mycket parallelliserade stegen tillverkning med hög genomströmning av monodispergerade HMP¹⁹.

Metakrylmodifierat gelatin (GelMA) HMP-byggstenar är termoresponsiva och (foto)kemiskt tvärbindningsbara, vilket möjliggör enkel GHS-tillverkning²⁰. Vid kylning under den övre kritiska lösningstemperaturen (UCST)²¹ (t.ex. vid 4 °C) omvandlas droppar som innehåller en GelMA-lösning till fysiskt tvärbundna HMP. Dessa HMP-byggstenar packas sedan med hjälp av externa krafter (t.ex. via centrifugering) för att ge fastnat mikrogelsuspensioner. Interpartikelbindningar upprättas mellan intilliggande HMP via (foto)kemisk tvärbindning för att bilda mekaniskt robust GHS¹⁴. En av de viktigaste egenskaperna hos GHS är mikroporositet, vilket möjliggör enkel cellpenetration in vitro¹¹ och förbättrad vävnadsinväxt in vivo²². Tredimensionell (3D) bioprinting av HMP utförs konventionellt med tätt packade mikrogelsuspensioner, vilket äventyrar mikroporositeten²³.

Vi har nyligen utvecklat en ny klass av granulära biobläck baserade på gränssnittsnanoengineering av GelMA-mikrogeler via adsorption av heterogent laddade nanopartiklar, följt av nanopartikelreversibel självmontering. Denna strategi gör löst packade mikrogeler skjuvavkastande och extrudering 3D bioprintbar, vilket bevarar mikroskala porositeten hos additivt tillverkade GHS¹¹. Denna artikel presenterar metoderna för tillverkning av GelMA-droppar med hög genomströmning, omvandling av dessa droppar till fysiskt tvärbundna HMP, tillverkning av GelMA HMP med resuspenderbart pulver, GelMA GHS-bildning, GelMA nanoengineered granulärt biobläckpreparat (NGB) och 3D-bioprinting.

Protocol

Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla material, instrument och reagenser som används i detta protokoll. 1. GelMA syntes OBS: GelMA-syntes bör utföras i en kemisk dragskåp och korrekt personlig skyddsutrustning (PPE) ska användas hela tiden. Tillsätt 200 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS, 1x) till en Erlenmeyerkolv och värm lösningen tills den når 50 °C. Täck kolven med alumin…

Representative Results

GelMA syntetiserades genom reaktion av gelatin med MA, som presenteras i figur 1A. Genom att skräddarsy reaktionsbetingelserna, såsom MA-koncentration, erhölls olika grader av MA-substitution. För att kvantifiera graden av MA-substitution bedömdes GelMA via 1H NMR-spektroskopi (figur 1B). Vinylfunktionella grupper med representativa toppar vid de kemiska skiften på ~ 5-6 ppm bekräftade den framgångsrika GelMA-syntesen från gelatin. R…

Discussion

Gelatin och dess derivat är de vanligaste proteinbaserade biomaterialen för HMP-tillverkning. Utmaningen med genomströmning kontra monodispersitetsavvägning av partikelstorlek kan övervinnas med hjälp av stegemulgerande mikrofluidiska enheter. Dessa enheter kan bilda mer än 40 miljoner droppar per timme, med en variationskoefficient mindre än 5%²⁷. I den här artikeln diskuterade vi mikrofabrikation av droppar som innehåller GelMA-lösningar, följt av att konvertera dem till GelMA HMP, p…

Materials

1H,1H-perfluoro-1-octanol	Alfa Aesar, MA, USA	B20156-18	98% purity
Biopsy punch	Integra Miltex, NY, USA	33-31A-P/25	1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System
Blunt needle	SANANTS	30-002-25	25 G
Bruker Avance NEO 400 MHz	400 MHz Bruker NEO, MA, USA		NMR device
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5415 C
Centrifuge tube	Celltreat, MA ,USA	229423
Coffee filters	BUNN, IL, USA	20104.0006	BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct
Desiccator	Thermo Scientific	5311-0250	Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD
Deuterium oxide	Sigma, MA, USA	151882
Dialysis membrane (12-14 kDa)	Spectrum Laboratories, NJ, USA	08-667E
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x)	Sigma, MA, USA	56064C-10L	dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture
Erlenmeyer flask	Corning, NY, USA	4980	Corning PYREX
Ethanol	VWR, PA, USA	89125-188	Koptec 200 proof
External thread cryogenic vials (cryovials)	Corning, NY, USA	430659
Freeze dryer	Labconco, MO, USA	71042000	Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)
Gelatin powder	Sigma, MA, USA	G1890-5100G	Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom
Glass microscope slides	VWR, PA, USA	82027-788
Hotplate	FOUR E'S SCIENTIFIC	MI0102003	5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F
Kimwipes	Fischer scientific, MA, USA	06-666
KMPR 1000 negative photoresist series	Kayaku Advanced Materials, MA, USA	121619	KMPR1025 and KMP1035 are included
LAPONITE XLG	BYK USA Inc., CT, USA	2344265
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma, MA, USA	900889-1G	>95%
Luer-Lok connector	BD, NJ, USA	BD 302995
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner	SÜSS MicroTeck, German		Nanofabrication device
Methacylate anhydride	Sigma, MA, USA	276685-100ML	contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94%
Milli-Q water	Millipore Corporation, MA, USA	ZRQSVR5WW	electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System
Novec 7500 engineering fluid	3M, MN, USA		3M ID 7100003723
Oven	VWR, PA, USA	VWR-1410	1410 Vacuum Oven
Parafilm	Fischer scientific, MA, USA	HS234526C
Pasteur pipette	VWR, PA, USA	14673-010
Petri dish	VWR, PA, USA	25384-092	polystyrene
Pico-Surf	Sphere Fluidics, UK	C022	(5% (w/w) in Novec 7500)
Pipette	VWR, PA, USA	89079-970
Pipette tips	VWR, PA, USA	87006-060
Plasma cleaner chamber	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-001-HP
Polydimethylsiloxane	Dow Corning, MI, USA	2065623	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
Positive displacement pipette	Microman E M100E, Gilson, OH, USA	M100E
Silicon wafers	UniversityWafer, MA, USA	452/1196	4-inch mechanical grade
Spatula	VWR, PA, USA	231-0104	Disposable
SU-8	Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Syringe pump	Harvard Apparatus, MA, USA	70-2001	PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Millipore Sigma, MA, USA	448931-10G	97%
Tygon tubings	Saint-globain, PA, USA	AAD04103
UV light	QUANS		Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W
Vacuum filtration unit	VWR, PA, USA	10040-460	0.20 µm
Vortex	Fischer scientific, USA	14-955-151	Mini Vortex Mixer