زرع داخل الصفاق لتوليد سرطان الدم النخاعي الحاد في الفئران
Summary
هنا ، يتم استخدام الحقن داخل الصفاق لخلايا سرطان الدم لإنشاء ونشر سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) في الفئران. هذه الطريقة الجديدة فعالة في الزرع التسلسلي لخلايا AML ويمكن أن تكون بمثابة بديل لأولئك الذين قد يواجهون صعوبات وتناقضات مع الحقن في الوريد في الفئران.
Abstract
هناك حاجة غير ملباة لعلاجات جديدة لعلاج ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) والانتكاس المرتبط به الذي يتضمن الخلايا الجذعية لسرطان الدم المستمر (LSCs). إن نموذج القوارض التجريبي ل AML لاختبار العلاجات القائمة على زرع هذه الخلايا بنجاح عن طريق الحقن المداري الخلفي في الفئران المتلقية محفوف بالتحديات. كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير طريقة سهلة وموثوقة ومتسقة لإنشاء نموذج فأر قوي من AML باستخدام طريق داخل الصفاق. في البروتوكول الحالي ، تم تحويل خلايا نخاع العظم مع فيروس قهقري يعبر عن البروتين الورمي الانصهاري البشري MLL-AF9. تم اختبار كفاءة مجموعات النسب السلبية (Lin-) و Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) كمانحين LSCs في تطوير AML الأولي ، وتم اعتماد الحقن داخل الصفاق كطريقة جديدة لتوليد AML. أجريت مقارنة بين الحقن داخل الصفاق والحقن خلف الحجاج في عمليات زرع متسلسلة لمقارنة وتباين الطريقتين. تم تحويل كل من خلايا Lin- و LSK مع فيروس MLL-AF9 البشري بشكل جيد في نخاع العظام والطحال من المتلقين ، مما أدى إلى ابيضاض الدم النقوي الحاد الكامل. أدى الحقن داخل الصفاق للخلايا المانحة إلى إنشاء AML في المتلقين عند الزرع التسلسلي ، وتم الكشف عن تسلل خلايا AML في الدم ونخاع العظام والطحال والكبد للمتلقين عن طريق قياس التدفق الخلوي و qPCR والتحليلات النسيجية. وبالتالي ، فإن الحقن داخل الصفاق هو وسيلة فعالة لتحريض AML باستخدام الزرع التسلسلي لخلايا اللوكيميا المانحة.
Introduction
ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) هو نوع من الأورام الخبيثة الدموية من مسببات متنوعة مع سوء التشخيص1. يضع جيل النماذج الحيوانية AML الأساس لفهم الاختلافات المعقدة والبيولوجيا المرضية في محاولة لاكتشاف علاجات جديدة2. يتضمن تكوين اللوكيم في الفئران زرع خلايا مانحة تعبر عن البروتينات السرطانية الانصهارية ، بما في ذلك عمليات الاندماج التي تنطوي على جين سرطان الدم المختلط (MLL) للحث بقوة على AML ، لتقليد المرض في البشر3. تم الإبلاغ عن أصول خلوية مختلفة للخلايا المانحة في زرعAML 4 المرتبط بجين MLL ، مع معرفة القليل جدا عن الخلايا المسؤولة عن أصل المرض.
تم تطوير طرق متعددة للزرع في الفئران. بدلا من الحقن داخل الفخذ ، الذي يدخل مباشرة خلايا مانحة متحولة في نخاع العظم5 ، تم استخدام الحقن الوريدي الذي يستخدم الضفيرة الجيبية الوريدية والوريد الذيل والوريد الوداجي على نطاق واسع لتوليد نماذج AML الفئران6،7،8،9. في حالة الحقن خلف المداري (r.o) ، كانت العديد من العيوب المتأصلة ، مثل الحد من الحجم ، والطلب التقني المرتفع ، وفرص قليلة للمحاولات المتكررة أو الخطأ ، وإصابات العين المحتملة ، عقبات رئيسية مع بدائل محدودة أو معدومة7. يمكن أن يكون لحقن الوريد الذيل مشاكل مماثلة إلى جانب الإصابات المحلية. لتسهيل الإجراء ، غالبا ما تحتاج الفئران إلى التسخين لتوسيع عروق الذيل10. من الصعب أيضا تحديد موقع الوريد الذيل بدون مصدر ضوء إضافي ، خاصة في سلالة الفئران C57BL / 6. بالنسبة لحقن الوريد الوداجي ، يحتاج موظفو البحث إلى تدريب كاف لتحديد موقع الوريد والحد من المضاعفات المحتملة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب إجراء كل من حقن الجيوب الأنفية الوريدية والوريد الوداجي تحت التخدير ، مما يضيف مستوى آخر من التعقيد. وبالتالي ، من المغري استكشاف طرق جديدة للزرع لتسهيل إنشاء نماذج الفئران AML.
يستخدم الحقن داخل الصفاق (i.p.) بشكل شائع لإدارة الأدوية والأصباغ والتخدير11،12،13،14،15 ؛ كما تم استخدامه لإدخال الخلايا المكونة للدم لتكوين الدم خارج الرحم16 وزرع الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظم في نماذج الفئرانالمختلفة 17،18،19،20،21. ومع ذلك ، فقد تم استخدامه بشكل غير متكرر لإنشاء الأورام الخبيثة المكونة للدم في الفئران ، وخاصة لدراسة تطور مرض AML.
تصف الدراسة الحالية جدوى حقن i.p. في توليد نماذج الفئران AML ، بالإضافة إلى مقارنة كفاءة زرع السكان سلبي النسب (Lin-) و Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) كخلايا مانحة. توفر هذه النتائج طريقة بسيطة وفعالة لإنشاء نماذج تجريبية من ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) وسرطان الدم النخاعي ذي الصلة. مثل هذه الطريقة لديها القدرة على زيادة فهمنا لآليات المرض وكذلك توفير نموذج سهل نسبيا لاختبار العلاجات التجريبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الدراسات الموصوفة أعلاه أدلة داعمة على أن زرع الخلايا اللينية يمكن مقارنته بخلايا LSK في توليد 1 درجة من AML الفأر. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر البيانات الحالية أيضا أن حقن i.p. هو وسيلة فعالة ومريحة لإنشاء AML الفئران مقارنة بالحقن في الوريد (أو r.o).
بالإضافة إلى خلايا LSK …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي التابع لمعهد هاك والمرفق الأساسي لعلم الأنسجة المرضي لمختبر تشخيص الحيوانات ، قسم العلوم البيطرية والطبية الحيوية ، جامعة ولاية بنسلفانيا ، على تقديم الدعم الفني في الوقت المناسب. تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الأمريكي لأبحاث السرطان (KSP) ، وكلية ولاية بنسلفانيا للعلوم الزراعية ، ومعهد ولاية بنسلفانيا للسرطان ، ومشروع USDA-NIFA 4771 ، ورقم الانضمام 00000005 إلى K.S.P. و R.F.P.
Materials
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
References
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
- Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
- Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
- Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
- Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. . The Laboratory Mouse. , (2001).
- Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
- Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
- Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, 106-117 (2011).
- Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
- Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
- Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
- Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
- Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
- Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
- Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
- Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
- Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
- Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
- Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
