생쥐에서 급성 골수성 백혈병을 발생시키기 위한 복강내 이식

요약

여기서, 백혈병 세포의 복강 내 주사는 마우스에서 급성 골수성 백혈병(AML)을 확립하고 전파하는 데 활용됩니다. 이 새로운 방법은 AML 세포의 연속 이식에 효과적이며 생쥐에서 정맥 주사에 어려움과 불일치를 경험할 수 있는 사람들을 위한 대안이 될 수 있습니다.

초록

급성 골수성 백혈병(AML) 및 지속성 백혈병 줄기 세포(LSC)와 관련된 관련 재발을 치료하기 위한 새로운 치료법에 대한 미충족 수요가 있습니다. 수용자 마우스에 역궤도 주사를 통해 이러한 세포를 성공적으로 이식하는 것을 기반으로 하는 치료법을 테스트하기 위한 실험적 AML 설치류 모델은 도전 과제로 가득 차 있습니다. 이 연구의 목적은 복강 내 경로를 사용하여 AML의 강력한 쥐 모델을 생성하는 쉽고 신뢰할 수 있으며 일관된 방법을 개발하는 것이었습니다. 본 프로토콜에서, 골수 세포는 인간 MLL-AF9 융합 종양 단백질을 발현하는 레트로바이러스로 형질도입되었다. 원발성 AML의 발달에서 기증자 LSC로서 계통 음성(Lin-) 및 Lin-Sca-1^+c-Kit+(LSK) 집단의 효율성을 테스트하고 AML을 생성하는 새로운 방법으로 복강내 주사를 채택했습니다. 복강내 주사와 안와후부 주사의 비교는 두 가지 방법을 비교하고 대조하기 위해 연속 이식에서 수행되었습니다. 인간 MLL-AF9 바이러스로 형질도입된 Lin^- 및 LSK 세포는 모두 수용자의 골수와 비장에 잘 생착되어 완전한 AML로 이어집니다. 연속 이식 시 공여자 세포의 복강 내 주사로 수혜자에게 AML이 형성되었고, 유세포 분석, qPCR 및 조직학적 분석을 통해 수혜자의 혈액, 골수, 비장 및 간에서 AML 세포의 침윤이 검출되었습니다. 따라서, 복강내 주사는 기증자 백혈병 세포의 연속 이식을 이용한 AML 유도의 효율적인 방법이다.

서론

급성 골수성 백혈병(AML)은 예후가 좋지 않은 다양한 병인의 혈액학적 악성 종양의 일종이다¹. AML 동물 모델의 생성은 새로운 치료법을 발견하기 위한 노력의 일환으로 복잡한 변이와 병리학을 이해하기 위한 토대를 마련한다². 생쥐의 백혈구 생성은 혼합 혈통 백혈병(mixed lineage leukemia, MLL) 유전자를 포함하는 융합체를 포함하여 융합 종양 단백질을 발현하는 공여 세포를 이식하여 AML을 강력하게 유도하여 인간의 질병을 모방하는 것을 포함한다³. MLL 유전자 관련 AML⁴의 이식에서 공여자 세포의 다양한 세포 기원이 보고되었으며, 질병 기원을 담당하는 세포에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.

생쥐 이식을 위해 여러 경로가 개발되었습니다. 돌연변이 공여 세포를^{골수 내}로 직접 도입하는 대퇴골 내 주사 5 대신, 정맥동 신경총, 꼬리 정맥 및 경정맥을 이용하는 정맥 주사가 쥐 AML 모델 6,7,8,9을 생성하는데 널리 사용되어 왔다.

프로토콜

모든 실험은 펜실베니아 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 사전 승인을 받았습니다.

1. 완충액 및 시약의 제조

1. 암피실린 보충 (AP) LB 한천 플레이트 (멸균 10cm 플레이트)를 준비하십시오. 이렇게하려면 400mL의 증류수에 한천과 함께 LB 국물 10g을 녹이고 저어주고 부피를 500mL까지 가져옵니다. 고압증기멸균으로 용액을 멸균한 다음 용액을 식히고 0.5mL의 암피실린(스톡: 150mg/mL)을 용액에 넣고 흔들어 혼합합니다. 즉시 알코올 램프 근처의 멸균된 10cm 플레이트에 18mL의 용액을 추가하고 실온에서 응고시킨 다음 추가 사용이 있을 때까지 플레이트를 4°C에서 거꾸로 보관합니다.
2. 500mL의 증류수에 한천 없이 LB 10g을 용해시켜 LB 배지를 준비합니다. 고압증기멸균으로 용액을 멸균하고 용액을 식히고 0.5mL의 암피실린(스톡: 150mg/mL)을 용액에 넣고 흔들어 혼합합니다.
3. 페니실린/스트렙토마이신 5mL와 열 비활성화 소 태아 혈청(hiFBS) 10mL를 1x 덜베코 인산염 완충 식염수(DPBS) 485mL에 추가하여 플로우 버퍼를 준비합니다.
   알림: 가열하여 FBS를 비활성화하려면 해동된 FBS 병을 56°C....

결과

r.o. 및 i.p.를 이용한 쥐 AML 세포의 이식 효율 비교 이식 경로
이전에는 MLL-AF9-형질도입된 LSK 세포로 안와후 후로 이식된 수용자 마우스에서 1° AML의 확립이 보고되었으며, 연속 이식에 의해 1° AML 세포의 이식 가능성이 입증되었습니다³⁰. 본 연구는 골수 Lin^-세포를 사용하여 이식을 수행할 가능성을 평가한 최초의 연구입니다. 비정상적인 백혈구 증가증(그림 2A)의 존재와 골수 및 비장에서 백혈병 세포(CD45.1⁺)의 침윤 증가(그림 2B)는 골수 Lin^-세포를 사용하여 1° AML을 생성하는 타당성을 뒷받침합니다. 질환 유도 기간을 비교하기 위해, 수용자당 2마리의 공여자 마우스를 안락사시켜 LSK 또는 Lin^-세포 중 어느 하나를 분리.......

토론

이러한 상술한 연구들은 Lin^- 세포의 이식이 1° 쥐 AML의 생성에서 LSK 세포와 비슷하다는 것을 뒷받침하는 증거를 제공한다. 또한, 현재 데이터는 i.p. 주사는 정맥 주사(또는 r.o.) 주사에 비해 쥐 AML을 확립하는 효율적이고 편리한 방법입니다.

LSK 세포 외에도 과립구-단핵구 전구체(GMP), 일반 림프구 전구체(CLP) 및 일반 골수 전구체(CMP)와 같은 다른 집단이 다양한 배양 기간^31,32를 갖는 1° MLL-AF9 유도 AML의 생성에서 기증자 세포로 대체되는 것으로 보고되었지만 정량적 비교가 부족하여 최적의 선택을 제안할 수 없습니다. 현재 연구에서, 동일한 기증자 마우스로부터 분리된 Lin- 및 LSK는 형질도입된 골수 전구 세포(Sca-1^-)가 AML^33.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
a-유능한 세포 선택	Bioline	BIO-85027
염화암모늄 (NH4Cl)	Sigma Aldrich	Cat# A-9434
암피실린	Sigma Aldrich	Cat# A0797
소 혈청 알부민 (BSA), 분획 V— 저내독소 등급	쌍둥이자리 바이오 제품	Cat# 700-102P
Ciprofloxacin HCl	GoldBio.com	Cat# C-861-100
DMEM, 고포도당, 글루타민 없음	Gibco	Cat# 11960-044
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 (PBS)	Corning	Cat# 21-031-CV
EDTA, 디소듐 염 (EDTA-2Na), 이수화물, 분자 생물학 등급	Calbiochem	Cat# 324503
태아 소 세럼 - 프리미엄 셀렉트	애틀랜타 생물학	Cat# S11550
홀로-트랜스페린, 소	시그마 알드리치	Cat# T1283
인슐린 용액 인간	시그마	Cat# I-9278
Iscove의 수정된 Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	Cat# 12440-053
L-glutamine 200 mM (100×) 용액	HyClone, Gelifesciences	Cat# SH30034.01
LB 육수, Lennox	NEOGEN	Cat #: 7290A
LB 한천 (Miller)이 있는 LB 육수Sigma	Aldrich	Cat# L-3147
마우스 anti-mouse CD45.1 (FITC)	Miltenyi Biotec	Cat# 130-124-211
마우스 인터루킨-3 (IL-3)	제미니 바이오 제품	Cat# 300-324P
마우스 인터루킨-6 (IL-6)	제미니 바이오 제품	Cat# 300-327P
마우스 줄기 세포 인자 (SCF)	제미니 바이오 제품	Cat# 300-348P
페니실린-스트렙토마이신 용액, 100x	코닝	Cat# 30-002-CI
Phenix-Eco (pECO) 셀	ATCC	CRL-3214
Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular	JT. Baker	Cat# 2940-01
Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)	BioLegend	고양이 # 105812
쥐 안티 마우스 Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)	BD Pharmingen	고양이# 558162
재조합 쥐 Flt3-Ligand	Pepro Tech, INC.	Cat# 250-31L
RetroNectin 재조합 인간 피브로넥틴 단편	TaKaRa	Cat# T100A
TransIT-293 시약	MirusBio	Cat# MIR 2705
TRI 시약	Sigma Aldrich	Cat# T9424
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	Cat # 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드	Gibco	Cat# 25200-056
β-Mercaptoethanol (BME)	Sigma Aldrich	Cat# M3148
Commercial Assays
EasySep 마우스 조혈 전구 세포 분리 키트	StemCell Technologies	Cat# 19856A
고용량 cDNA 역전사 키트	써모 피셔	Cat# 4368813
PerfeCTa qPCR SuperMix	Quanta Bio	Cat# 95051-500
플라스미드 맥시 키트 (25)	Qiagen	Cat#:12163
Animals
Ai14TdTomato mice	Jackson Laboratory	Strain # 007914
CD45.1 C57BL6/J 마우스& 주의;	잭슨 실험실	균주 # 002014
CD45.2 C57BL6/J 마우스	잭슨 실험실	균주 # 000664
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