चूहों में तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया उत्पन्न करने के लिए इंट्रा-पेरिटोनियल प्रत्यारोपण
Summary
यहां, ल्यूकेमिया कोशिकाओं के इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग चूहों में तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) को स्थापित करने और फैलाने के लिए किया जाता है। यह नई विधि एएमएल कोशिकाओं के सीरियल प्रत्यारोपण में प्रभावी है और उन लोगों के लिए एक विकल्प के रूप में काम कर सकती है जो चूहों में अंतःशिरा इंजेक्शन के साथ कठिनाइयों और विसंगतियों का अनुभव कर सकते हैं।
Abstract
तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) और संबंधित रिलैप्स के इलाज के लिए नवीन उपचारों की आवश्यकता है जिसमें लगातार ल्यूकेमिया स्टेम सेल (एलएससी) शामिल हैं। प्राप्तकर्ता चूहों में रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन के माध्यम से इन कोशिकाओं को सफलतापूर्वक प्रत्यारोपण करने के आधार पर उपचारों का परीक्षण करने के लिए एक प्रयोगात्मक एएमएल कृंतक मॉडल चुनौतियों से भरा है। इस अध्ययन का उद्देश्य इंट्रा-पेरिटोनियल मार्ग का उपयोग करके एएमएल के एक मजबूत मुराइन मॉडल को उत्पन्न करने के लिए एक आसान, विश्वसनीय और सुसंगत विधि विकसित करना था। वर्तमान प्रोटोकॉल में, अस्थि मज्जा कोशिकाओं को मानव एमएलएल-एएफ 9 संलयन ऑन्कोप्रोटीन को व्यक्त करने वाले रेट्रोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। प्राथमिक एएमएल के विकास में दाता एलएससी के रूप में वंश नकारात्मक (लिन–) और लिन-एससीए -1 + सी-किट + (एलएसके) आबादी की दक्षता का परीक्षण किया गया था, और एएमएल उत्पन्न करने के लिए इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन को एक नई विधि के रूप में अपनाया गया था। इंट्रा-पेरिटोनियल और रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन के बीच तुलना सीरियल प्रत्यारोपण में दो तरीकों की तुलना और विपरीत करने के लिए की गई थी। लिन– और एलएसके दोनों कोशिकाओं को मानव एमएलएल-एएफ 9 वायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया, जो प्राप्तकर्ताओं के अस्थि मज्जा और प्लीहा में अच्छी तरह से संलग्न थे, जिससे एक पूर्ण विकसित एएमएल हुआ। दाता कोशिकाओं के इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन ने सीरियल प्रत्यारोपण पर प्राप्तकर्ताओं में एएमएल की स्थापना की, और एएमएल कोशिकाओं की घुसपैठ को फ्लो साइटोमेट्री, क्यूपीसीआर और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा प्राप्तकर्ताओं के रक्त, अस्थि मज्जा, प्लीहा और यकृत में पाया गया। इस प्रकार, इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन दाता ल्यूकेमिक कोशिकाओं के सीरियल प्रत्यारोपण का उपयोग करके एएमएल प्रेरण का एक कुशल तरीका है।
Introduction
तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल)खराब रोग निदान के साथ विविध एटियलजि की हेमेटोलॉजिक दुर्भावना का एक प्रकार है। एएमएल पशु मॉडल की पीढ़ी नए उपचारों की खोज के प्रयास में इसकी जटिल विविधताओं और पैथोबायोलॉजी की समझ की नींवरखती है। चूहों में ल्यूकेमोजेनेसिस में संलयन ऑन्कोप्रोटीन व्यक्त करने वाली दाता कोशिकाओं का प्रत्यारोपण शामिल है, जिसमें मिश्रित वंश ल्यूकेमिया (एमएलएल) जीन को एएमएल को शक्तिशाली रूप से प्रेरित करने के लिए संलयन शामिल है, ताकि मनुष्यों में बीमारी की नकल कीजा सके। एमएलएल जीन से जुड़े एएमएल4 के प्रत्यारोपण में दाता कोशिकाओं की विभिन्न सेलुलर उत्पत्ति की सूचना दी गई है, जिसमें रोग की उत्पत्ति के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं के बारे में बहुत कम जानकारी है।
चूहों में प्रत्यारोपण के लिए कई मार्ग विकसित किए गए हैं; एक इंट्रा-फेमोरल इंजेक्शन के बजाय, जो सीधे अस्थि मज्जा5 में उत्परिवर्ती दाता कोशिकाओं का परिचय देता है, एक अंतःशिरा इंजेक्शन जो शिरापरक साइनस प्लेक्सस, पूंछ की नस और जुगुलर नस का उपयोग करता है, व्यापक रूप से मुराइन एएमएल मॉडल 6,7,8,9 उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया है। रेट्रो-ऑर्बिटल (आर.ओ.) इंजेक्शन के मामले में, विभिन्न अंतर्निहित नुकसान, जैसे कि मात्रा सीमा, उच्च तकनीकी मांग, बार-बार प्रयासों या त्रुटि के लिए कुछ संभावनाएं, और संभावित ओकुलर चोटें, सीमित या बिना किसी व्यवहार्य विकल्पके साथ प्रमुख बाधाएं रही हैं। टेल वेन इंजेक्शन में स्थानीय चोटों के अलावा समान समस्याएं हो सकती हैं; प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए, चूहों को अक्सर अपनी पूंछनसों को पतला करने के लिए गर्म करने की आवश्यकता होती है। अतिरिक्त प्रकाश स्रोत के बिना पूंछ की नस का पता लगाना भी मुश्किल है, खासकर चूहों के सी 57बीएल / 6 तनाव में। जुगुलर नस इंजेक्शन के लिए, अनुसंधान कर्मियों को नस का पता लगाने और संभावित जटिलताओं को सीमित करने के लिए पर्याप्त प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, शिरापरक साइनस और जुगुलर नस इंजेक्शन दोनों को संज्ञाहरण के तहत करने की आवश्यकता होती है, जो जटिलता का एक और स्तर जोड़ता है। इस प्रकार, एएमएल मुराइन मॉडल की स्थापना की सुविधा के लिए प्रत्यारोपण के लिए नए मार्गों का पता लगाना आकर्षक है।
इंट्रा-पेरिटोनियल (आई.पी.) इंजेक्शन का उपयोग आमतौर पर दवाओं, रंगों और एनेस्थेटिक्स11,12,13,14,15 को प्रशासित करने के लिए किया जाता है; इसका उपयोग एक्टोपिक हेमटोपोइजिस 16 के लिए हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को पेश करने और विभिन्न माउस मॉडल 17,18,19,20,21 में अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने के लिए भी किया गया है। हालांकि, इसका उपयोग अक्सर चूहों में हेमटोपोइएटिक विकृतियों को स्थापित करने के लिए किया जाता है, विशेष रूप से एएमएल रोग की प्रगति का अध्ययन करने के लिए।
वर्तमान अध्ययन दाता कोशिकाओं के रूप में वंश नकारात्मक (लिन-) और लिन-एससीए -1 + सी-किट + (एलएसके) आबादी की प्रत्यारोपण दक्षता की तुलना करने के अलावा, एएमएल माउस मॉडल की पीढ़ी में आईपी इंजेक्शन की व्यवहार्यता का वर्णन करता है। ये निष्कर्ष एएमएल और संबंधित माइलॉयड ल्यूकेमिया के प्रयोगात्मक मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक सरल और कुशल तरीका प्रदान करते हैं। इस तरह की विधि में रोग तंत्र की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के साथ-साथ प्रयोगात्मक उपचारों का परीक्षण करने के लिए अपेक्षाकृत आसान मॉडल प्रदान करने की क्षमता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ये उपर्युक्त वर्णित अध्ययन सहायक सबूत प्रदान करते हैं कि लिन-कोशिकाओं का प्रत्यारोपण 1 ° मुराइन एएमएल की पीढ़ी में एलएसके कोशिकाओं के बराबर है। इसके अलावा, वर्तमान डेटा से यह भी पता चलता है कि अंतःश…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने समय पर तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए हक इंस्टीट्यूट की फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा और पशु नैदानिक प्रयोगशाला, पशु चिकित्सा और जैव चिकित्सा विज्ञान विभाग, पेंसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी की हिस्टोपैथोलॉजी कोर सुविधा को धन्यवाद दिया। इस काम को अमेरिकन इंस्टीट्यूट फॉर कैंसर रिसर्च (केएसपी), पेन स्टेट कॉलेज ऑफ एग्रीकल्चरल साइंसेज, पेन स्टेट कैंसर इंस्टीट्यूट, यूएसडीए-निफा प्रोजेक्ट 4771, केएसपी और आरएफपी के लिए परिग्रहण संख्या 00000005 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
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