Intraperitoneal transplantation för att generera akut myeloisk leukemi hos möss
Summary
Här används intraperitoneal injektion av leukemiceller för att etablera och sprida akut myeloisk leukemi (AML) hos möss. Denna nya metod är effektiv vid serietransplantation av AML-celler och kan fungera som ett alternativ för dem som kan uppleva svårigheter och inkonsekvenser med intravenös injektion hos möss.
Abstract
Det finns ett ouppfyllt behov av nya terapier för att behandla akut myeloisk leukemi (AML) och tillhörande återfall som involverar ihållande leukemistamceller (LSC). En experimentell AML-gnagarmodell för att testa terapier baserade på framgångsrik transplantation av dessa celler via retroorbitala injektioner i mottagarmöss är full av utmaningar. Syftet med denna studie var att utveckla en enkel, tillförlitlig och konsekvent metod för att generera en robust murin modell av AML med hjälp av en intraperitoneal väg. I det nuvarande protokollet transducerades benmärgsceller med ett retrovirus som uttrycker humant MLL-AF9-fusionsonkoprotein. Effektiviteten hos härstamningsnegativa (Lin-) och Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) populationer som donator-LSC vid utvecklingen av primär AML testades och intraperitoneal injektion antogs som en ny metod för att generera AML. Jämförelse mellan intraperitoneala och retroorbitala injektioner gjordes i serietransplantationer för att jämföra och kontrastera de två metoderna. Både Lin– och LSK-celler transducerade med humant MLL-AF9-virus transplanterade väl i benmärgen och mjälten hos mottagare, vilket ledde till en fullblåst AML. Den intraperitoneala injektionen av donatorceller etablerade AML hos mottagare vid serietransplantation, och infiltration av AML-celler detekterades i blod, benmärg, mjälte och lever hos mottagare genom flödescytometri, qPCR och histologiska analyser. Således är intraperitoneal injektion en effektiv metod för AML-induktion med seriell transplantation av donatorleukemiska celler.
Introduction
Akut myeloisk leukemi (AML) är en typ av hematologisk malignitet av olika etiologi med dålig prognos1. Genereringen av AML-djurmodeller lägger grunden för förståelsen av dess komplexa variationer och patobiologi i ett försök att upptäcka nya terapier2. Leukemogenes hos möss involverar transplantation av donatorceller som uttrycker fusions-onkoproteiner, inklusive fusioner som involverar genen blandad härstamningsleukemi (MLL) för att kraftigt inducera AML, för att efterlikna sjukdomen hos människor3. Olika cellulära ursprung av donatorceller har rapporterats vid transplantation av MLL-genassocierad AML4, med mycket lite känt om cellerna som är ansvariga för sjukdomens ursprung.
Flera vägar har utvecklats för transplantation på möss; I stället för en intrafemoral injektion, som direkt introducerar mutanta donatorceller i benmärg5, har en intravenös injektion som använder venös sinusplexus, svansven och halsvenen använts i stor utsträckning för att generera murina AML-modeller 6,7,8,9. När det gäller retroorbital injektion (r.o.) har olika inneboende nackdelar, såsom volymbegränsning, hög teknisk efterfrågan, få chanser till upprepade försök eller fel och potentiella ögonskador, varit stora stötestenar med begränsade eller inga genomförbara alternativ7. Svansveninjektion kan ha liknande problem förutom lokala skador; För att underlätta proceduren måste möss ofta värmas upp för att utvidga svansvenerna10. Det är också svårt att lokalisera svansvenen utan en extra ljuskälla, särskilt i C57BL/6-stammen hos möss. För injektion av halsvenen kräver forskningspersonal tillräcklig utbildning för att lokalisera venen och begränsa eventuella komplikationer. Dessutom måste både venösa sinus- och halsveninjektioner utföras under anestesi, vilket ger en annan nivå av komplexitet. Därför är det frestande att utforska nya vägar för transplantation för att underlätta upprättandet av AML-murina modeller.
Intraperitoneal (i.p.) injektion används ofta för att administrera läkemedel, färgämnen och anestetika 11,12,13,14,15; Det har också använts för att introducera hematopoetiska celler för ektopisk hematopoes16 och för att transplantera benmärgshärledda mesenkymala stamceller i olika musmodeller 17,18,19,20,21. Det har dock sällan använts för att etablera hematopoetiska maligniteter hos möss, särskilt för att studera AML-sjukdomsprogression.
Den aktuella studien beskriver genomförbarheten av i.p. injektion i genereringen av AML-musmodeller, förutom att jämföra transplantationseffektiviteten hos härstamningsnegativa (Lin-) och Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) populationer som donatorceller. Dessa fynd ger ett enkelt och effektivt sätt att generera experimentella modeller av AML och relaterade myeloida leukemier. En sådan metod har potential att öka vår förståelse av sjukdomsmekanismerna samt ge en relativt enkel modell för att testa experimentella terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dessa ovan beskrivna studier ger stödjande bevis för att transplantationen av linceller är jämförbar med LSK-celler vid generering av 1° murin AML. Dessutom visar aktuella data också att intravenös (eller r.o.) injektion är en effektiv och bekväm metod för att fastställa murin AML jämfört med intravenös (eller r.o.) injektion.
Förutom LSK-celler har andra populationer såsom granulocytmonocytprogenitor (GMP), vanlig lymfoid stamfader (CLP) och vanlig myeloisk stamfad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Huck Institute’s Flow Cytometry Core Facility och Histopathology Core Facility of the Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Pennsylvania State University, för att ge snabb teknisk support. Detta arbete stöddes av bidrag från American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA-projekt 4771, anslutningsnummer 00000005 till K.S.P. och RFP.
Materials
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
References
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
- Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
- Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
- Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
- Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. . The Laboratory Mouse. , (2001).
- Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
- Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
- Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, 106-117 (2011).
- Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
- Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
- Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
- Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
- Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
- Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
- Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
- Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
- Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
- Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
- Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
