기니피그 눈에서 망막 색소 상피 세포의 분리
Summary
우리는 어린 색소 기니피그의 눈에서 망막 색소 상피(RPE) 세포의 세포를 분리하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 절차를 통해 유전자 발현 분석을 포함하여 분리된 RPE에 대한 후속 분자 생물학 연구가 가능합니다.
Abstract
이 프로토콜은 유전자 발현 분석을 포함한 분자 생물학 연구에 잠재적으로 적용하기 위해 어린 색소 기니피그의 눈에서 망막 색소 상피(RPE) 세포를 분리하는 것을 설명합니다. 눈 성장 조절 및 근시의 맥락에서 RPE는 망막과 맥락막 및 공막과 같은 눈의 두 벽 사이에 위치하기 때문에 성장 조절 신호에 대한 세포 중계자 역할을 할 가능성이 높습니다. RPE를 분리하기 위한 프로토콜은 병아리와 생쥐 모두를 위해 개발되었지만 이러한 프로토콜은 중요하고 널리 사용되는 포유류 근시 모델이 된 기니피그로 직접 번역할 수 없는 것으로 입증되었습니다. 이 연구에서는 분자 생물학 도구를 사용하여 특정 유전자의 발현을 검사하여 샘플에 인접 조직의 오염이 없는지 확인했습니다. 이 프로토콜의 가치는 근시를 유발하는 광학 디포커스에 노출된 어린 색소 기니피그의 RPE에 대한 RNA-Seq 연구에서 이미 입증되었습니다. 눈 성장 조절 외에도 이 프로토콜은 RPE가 연루된 근시 실명의 주요 원인 중 하나인 근시 황반병증을 포함하여 망막 질환 연구에 다른 잠재적인 응용 분야를 가지고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 일단 완성되면 RNA 분석을 포함한 분자 생물학 연구에 적합한 고품질 RPE 샘플을 얻을 수 있다는 것입니다.
Introduction
RPE는 신경 망막과 혈관 맥락막 사이에 위치한 색소 세포의 독특한 단층으로 구성되며, RPE는 광형질도입 1,2을 포함하여 정상적인 망막 기능의 발달 및 유지에 잘 알려진 역할을 합니다. 최근에, RPE는 눈 성장 조절3 및 근시 4의 발달에 추가적인 핵심 역할을 할당받았다. 이 할당은 망막과 맥락막 사이에 개재된 RPE의 중요한 위치와 눈의 성장과 굴절 이상이 국소적으로 조절된다는 현재 널리 받아들여지고 있는 것을 기반으로 합니다5. RPE는 성장 조절 신호의 원천으로 추정되는 망막을 중계 신호의 두 표적인 맥락막과 공막에 연결하는 신호 중계자로서 핵심적인 역할을 하는 것으로 여겨집니다(6,7,8).
대부분의 근시를 특징짓는 축 길이의 증가는 양성으로 간주될 수 없으며, 망막, 맥락막 및/또는 공막과 관련된 병태생리학적 변화는 과도한 안구 신장의 피할 수 없고 현재 잘 알려진 결과를 나타냅니다 7,9. 이러한 맥락에서 RPE는 비유사분열 조직이기 때문에 개별 세포의 스트레칭 및 얇아짐에 의해서만 확장되는 유리체실을 수용할 수 있기 때문에 아마도 가장 취약할 것입니다. 근시성 황반변성과 같은 근시 관련 병리에서의 역할은 아직 완전히 이해되지 않았지만, RPE는 망막, RPE 및 맥락막의 문서화된 이상과 관련된 실명의 주요 원인 중 하나인 지리적 위축을 포함한 여러 다른 망막 질환의 발병기전과 관련이 있습니다10,11, 12.
인접한 안구 조직의 오염이 없는 RPE 세포의 성공적인 분리는 잠재적으로 다양한 눈/망막 질환의 기본 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 많은 연구 기회를 열어줍니다. 그러나 RPE의 분리는 어려운 것으로 입증되었으며, 이러한 이유로 결합된 망막/RPE 또는 RPE/맥락막 샘플을 사용하는 많은 발표된 연구에서 13,14,15. 분자 생물학 연구에 적합한 품질의 RPE의 성공적인 분리와 관련된 연구는 병아리와 생쥐의 눈으로 제한되었다16,17. 예를 들어, Wang et al.18에 의해 기술된 동시 RPE 분리 및 RNA 안정화 (SRIRS) 방법. 생쥐에서 RPE 세포를 분리하는 것은 기니피그 눈에서 잘 작동하지 않는 것으로 보입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 저자 중 한 명(M.F.)이 처음에 나무 뒤쥐 눈으로 프로토타입을 만든 접근 방식을 개선한 것으로, 어린 색소 기니피그의 눈에서 RNA 및 기타 분자 생물학 분석에 적합한 고품질 RPE 샘플을 산출하는 것으로 입증되었습니다19.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서는 어린 색소 기니피그의 눈에서 RPE 유전자 발현 분석에 적합한 RPE를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 장점은 RNA가 RNA 특이적 분석에 적합하게 보존되어 상대적으로 오염이 없는 고품질 RPE 샘플을 생성하면서도 비교적 간단하고 효율적이라는 것입니다. 여기에 제공된 예에서 RPE 샘플은 어린(2주령) 기니피그의 눈에서 수집되었지만 프로토콜은 나이가 많은(젊은 성인) 동물…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 일본 과학 진흥 협회 해외 연구 펠로우십(S.G.), Loris and David Rich 박사후 연구원(S.G.) 및 국립 보건원 국립 안과 연구소(R01EY012392; C.F.W.)입니다.
Materials
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
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