Isolering av retinala pigmentepitelceller från marsvinsögon
Summary
Vi beskriver en enkel och effektiv metod för att isolera celler i retinala pigmentepitelceller (RPE) från ögonen på unga pigmenterade marsvin. Denna procedur möjliggör uppföljande molekylärbiologiska studier på den isolerade RPE, inklusive genuttrycksanalyser.
Abstract
Detta protokoll beskriver isoleringen av celler i retinalt pigmentepitel (RPE) från ögonen på unga pigmenterade marsvin för potentiell tillämpning i molekylärbiologiska studier, inklusive genuttrycksanalyser. I samband med ögontillväxtreglering och myopi spelar RPE sannolikt en roll som ett cellulärt relä för tillväxtmodulerande signaler, eftersom det ligger mellan näthinnan och de två väggarna i ögat, såsom choroid och sclera. Medan protokoll för isolering av RPE har utvecklats för både kycklingar och möss, har dessa protokoll visat sig inte vara direkt översättbara till marsvinet, vilket har blivit en viktig och allmänt använd däggdjursmyopimodell. I denna studie användes molekylärbiologiska verktyg för att undersöka uttrycket av specifika gener för att bekräfta att proverna var fria från kontaminering från de intilliggande vävnaderna. Värdet av detta protokoll har redan visats i en RNA-Seq-studie av RPE från unga pigmenterade marsvin som exponerats för myopiinducerande optisk oskärpa. Utöver reglering av ögontillväxt har detta protokoll andra potentiella tillämpningar i studier av näthinnesjukdomar, inklusive myopisk makulopati, en av de främsta orsakerna till blindhet hos myopes, där RPE har varit inblandad. Den största fördelen med denna teknik är att den är relativt enkel och när den är perfekt, ger högkvalitativa RPE-prover som är lämpliga för molekylärbiologiska studier, inklusive RNA-analys.
Introduction
RPE består av ett unikt monolager av pigmenterade celler som ligger mellan den neurala näthinnan och den vaskulära koroiden, och RPE har välkända roller i utvecklingen och upprätthållandet av normal retinal funktion, inklusive fototransduktion 1,2. På senare tid har RPE tilldelats en ytterligare nyckelroll i ögontillväxtreglering3 och därmed utvecklingen av närsynthet4. Denna uppgift är baserad på RPE: s kritiska plats, placerad mellan näthinnan och choroid och den nu breda acceptansen att ögontillväxt och därmed brytningsfel regleras lokalt5. RPE tros spela en nyckelroll som ett signalrelä, som förbinder näthinnan, den antagna källan till tillväxtmodulerande signaler, till choroid och sclera, de två målen för de vidarebefordrade signalerna 6,7,8.
Den ökning av axiell längd som kännetecknar de flesta närsyntheter kan inte betraktas som godartad, med patofysiologiska förändringar som involverar näthinnan, åderhinnan och/eller sclera som representerar oundvikliga och nu välkända konsekvenser av överdriven okulär förlängning 7,9. I detta sammanhang är RPE kanske den mest sårbara, eftersom den är en icke-mitotisk vävnad och endast kan rymma den expanderande glaskroppen genom sträckning och gallring av enskilda celler. Medan dess roll i myopirelaterade patologier, såsom myopisk makuladegeneration, ännu inte är helt förstådd, har RPE varit inblandad i patogenesen av ett antal andra näthinnesjukdomar, inklusive geografisk atrofi, en av de främsta orsakerna till blindhet, som är förknippad med dokumenterade abnormiteter i näthinnan, RPE och choroid10,11, 12.
Den framgångsrika isoleringen av RPE-celler, fria från kontaminering från intilliggande ögonvävnader, öppnar potentiellt många forskningsmöjligheter för att få nya insikter om mekanismerna bakom en mängd olika ögon- / näthinnesjukdomar. Isoleringen av RPE har dock visat sig vara utmanande, med många publicerade studier som använder kombinerade retina / RPE eller RPE / choroidprover av denna anledning13,14,15. Studier som involverar framgångsrik isolering av RPE av en kvalitet som lämpar sig för molekylärbiologiska studier har begränsats till kyckling- och musögon16,17. Till exempel metoden för samtidig RPE-isolering och RNA-stabilisering (SRIRS) som beskrivs av Wang et al.18. Att isolera RPE-celler hos möss verkar inte fungera bra i marsvinsögon. Protokollet som beskrivs här representerar en förfining av ett tillvägagångssätt som ursprungligen prototypades med trädnäbbögon av en av författarna (MF) och har visat sig ge högkvalitativa RPE-prover, lämpliga för RNA och andra molekylärbiologiska analyser, från ögonen på unga pigmenterade marsvin19.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här artikeln beskriver vi en metod för att isolera RPE, lämplig för RPE-genuttrycksanalyser, från ögonen på unga, pigmenterade marsvin. Fördelarna med detta protokoll är att det ger högkvalitativa RPE-prover som är relativt fria från kontaminering, med RNA lämpligt bevarat för RNA-specifika analyser och ändå är relativt enkelt och effektivt. Medan i exemplet som ges här samlades RPE-proverna från ögonen på ett ungt (2 veckor gammalt) marsvin, har protokollet också använts framgångsrikt för …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöds av Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (SG), en Loris och David Rich Postdoctoral Scholar (SG) och ett bidrag från National Eye Institute of National Institutes of Health (R01EY012392; C.F.W.).
Materials
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium – from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi – Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch’s membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J. The multifunctional choroid. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
