Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Humanas em Aglomerados de Ilhotas Produtoras de Insulina
Summary
A diferenciação de células-tronco em ilhotas fornece uma solução alternativa ao tratamento convencional do diabetes e à modelagem da doença. Descrevemos um protocolo detalhado de cultura de células-tronco que combina um kit de diferenciação comercial com um método previamente validado para auxiliar na produção de ilhotas derivadas de células-tronco secretoras de insulina em um prato.
Abstract
A diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em células beta secretoras de insulina fornece material para investigar a função das células beta e o tratamento do diabetes. No entanto, permanecem desafios na obtenção de células beta derivadas de células-tronco que mimetizem adequadamente as células beta humanas nativas. Com base em estudos anteriores, células de ilhotas derivadas de hPSC foram geradas para criar um protocolo com melhores resultados de diferenciação e consistência. O protocolo aqui descrito utiliza um kit progenitor pancreático durante os estágios 1-4, seguido por um protocolo modificado de um artigo publicado anteriormente em 2014 (doravante denominado “protocolo R”) durante os estágios 5-7. Procedimentos detalhados para o uso do kit de progenitores pancreáticos e placas de micropoços de 400 μm de diâmetro para gerar clusters de progenitores pancreáticos, protocolo R para diferenciação endócrina em um formato de suspensão estática de 96 poços e caracterização in vitro e avaliação funcional de ilhotas derivadas de hPSC são incluídos. O protocolo completo leva 1 semana para a expansão inicial da hPSC seguida por ~5 semanas para obter ilhotas hPSC produtoras de insulina. Pessoal com técnicas básicas de cultura de células-tronco e treinamento em ensaios biológicos pode reproduzir esse protocolo.
Introduction
As células beta pancreáticas secretam insulina respondendo a aumentos nos níveis de glicose no sangue. Pacientes sem produção suficiente de insulina devido à destruição autoimune das células beta no diabetes tipo 1 (DM1)1, ou devido à disfunção das células beta no diabetes tipo 2 (DM2)2, são tipicamente tratados com a administração de insulina exógena. Apesar dessa terapia que salva vidas, ela não pode corresponder precisamente ao controle requintado da glicose no sangue, como alcançado pela secreção dinâmica de insulina das células beta de boa-fé. Como tal, os pacientes frequentemente sofrem as consequências de episódios hipoglicêmicos com risco de vida e outras complicações resultantes de excursões hiperglicêmicas crônicas. O transplante de ilhotas de cadáveres humanos restaura com sucesso o controle glicêmico rigoroso em pacientes com DM1, mas é limitado pela disponibilidade de ilhotas doadoras e dificuldades na purificação de ilhotas saudáveis para transplante 3,4. Este desafio pode, em princípio, ser resolvido com o uso de hPSCs como material de partida alternativo.
As estratégias atuais de geração de ilhotas secretoras de insulina a partir de hPSCs in vitro frequentemente visam mimetizar o processo de desenvolvimento do pâncreas embrionário in vivo 5,6. Isso requer conhecimento das vias de sinalização responsáveis e adição cronometrada de fatores solúveis correspondentes para mimetizar estágios críticos do pâncreas embrionário em desenvolvimento. O programa pancreático inicia-se com o comprometimento na endoderme definitiva, que é marcada pelos fatores de transcrição forkhead box A2 (FOXA2) e região determinante do sexo Y-box 17 (SOX17)7. A diferenciação sucessiva da endoderme definitiva envolve a formação de um tubo intestinal primitivo, padronizado em um intestino anterior posterior que expressa a homeocaixa 1 pancreática e duodenal (PDX1)7,8,9, e expansão epitelial em progenitores pancreáticos que co-expressam PDX1 e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)10,11.
Um maior comprometimento com as células das ilhotas endócrinas é acompanhado pela expressão transitória do regulador mestre pró-endócrino neurogenina-3 (NGN3)12 e indução estável dos principais fatores de transcrição diferenciação neuronal 1 (NEUROD1) e NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. As principais células que expressam hormônios, como células beta produtoras de insulina, células alfa produtoras de glucagon, células delta produtoras de somatostatina e células PPY produtoras de polipeptídeos pancreáticos, são subsequentemente programadas. Com esse conhecimento, bem como descobertas de extensos estudos de triagem de drogas em alto rendimento, avanços recentes têm possibilitado a geração de ilhotas hPSC com células semelhantes às células beta capazes de secreção de insulina 14,15,16,17,18,19.
Protocolos step-wise têm sido relatados para gerar células beta responsivas à glicose 6,14,18,19. Com base nesses estudos, o presente protocolo envolve o uso de um kit de progenitores pancreáticos para gerar células progenitoras pancreáticas PDX1+/NKX6.1+ em uma cultura plana, seguido pela agregação da placa de micropoços em agrupamentos de tamanho uniforme e diferenciação adicional para ilhotas hPSC secretoras de insulina com o protocolo R em uma cultura de suspensão 3D estática. Análises de controle de qualidade, incluindo citometria de fluxo, imunomarcação e avaliação funcional, são realizadas para caracterização rigorosa das células diferenciadoras. Este trabalho fornece uma descrição detalhada de cada etapa da diferenciação dirigida e delineia as abordagens de caracterização in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho descreve um protocolo híbrido de sete estágios que permite a geração de ilhotas hPSC capazes de secretar insulina após desafio glicêmico dentro de 40 dias de cultura in vitro. Dentre essas múltiplas etapas, acredita-se que a indução eficiente da endoderme definitiva seja um importante ponto de partida para os resultados finais dediferenciação18,27,28. No protocolo do fabricante, uma densidade de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o apoio da STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF e dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde. Jia Zhao e Shenghui Liang recebem o Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam recebeu a Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima recebeu a Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship e o CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. Agradecemos sinceramente ao Dr. Edouard G. Stanley da MCRI e da Monash University por compartilhar a linha Mel1 INS GFP/W e o Alberta Diabetes Institute Islet Core por isolar e distribuir ilhotas humanas. Também agradecemos o apoio das instalações de Imagem e Citometria de Fluxo do Instituto de Ciências da Vida da Universidade da Colúmbia Britânica. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.
Materials
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
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