Induktion af parodontitis via en kombination af ligatur og lipopolysaccharidinjektion i en rottemodel
Summary
I denne undersøgelse præsenteres en rottemodel for induktion af parodontitis via en kombination af retentiv ligatur og gentagne injektioner af lipopolysaccharid afledt af Porphyromonas gingivalis, over 14 dage omkring de første maksillære molarer. Ligerings- og LPS-injektionsteknikkerne var effektive til at inducere peridontitis, hvilket resulterede i alveolært knogletab og betændelse.
Abstract
Parodontitis (PD) er en meget udbredt, kronisk immuninflammatorisk sygdom i periodontium, der resulterer i tab af tandkødsblødt væv, parodontalt ledbånd, cementum og alveolær knogle. I denne undersøgelse beskrives en simpel metode til PD-induktion hos rotter. Vi giver detaljerede instruktioner til placering af ligaturmodellen omkring de første maksillære molarer (M1) og en kombination af injektioner af lipopolysaccharid (LPS), afledt af Porphyromonas gingivalis på mesio-palatal side af M1. Induktionen af parodontitis blev opretholdt i 14 dage, hvilket fremmer akkumulering af bakterier biofilm og inflammation. For at validere dyremodellen blev IL-1β, en vigtig inflammatorisk mediator, bestemt ved et immunoassay i tandkødscrevikulær væske (GCF), og alveolært knogletab blev beregnet ved anvendelse af keglestrålecomputertomografi (CBCT). Denne teknik var effektiv til at fremme tandkødsrecession, alveolært knogletab og en stigning i IL-1β-niveauer i GCF ved afslutningen af den eksperimentelle procedure efter 14 dage. Denne metode var effektiv til at inducere PD og kunne således anvendes i undersøgelser af sygdomsprogressionsmekanismer og fremtidige mulige behandlinger.
Introduction
Parodontitis (PD) er den sjette mest udbredte folkesundhedstilstand på verdensplan, der påvirker ca. 11% af den samlede befolkning og er en avanceret, irreversibel og destruktiv form for periodontal sygdom 1,2. PD er en inflammatorisk proces, der påvirker tandkøds- og periodontalvævet, hvilket resulterer i tandkødsrecession, apikal migration af krydsepitelet med lommeudvikling og tab af alveolær knogle3. Desuden er PD forbundet med flere systemiske sygdomme, herunder hjerte-kar-sygdomme, fedme, diabetes og leddegigt, hvor miljømæssige og værtsspecifikke faktorer spiller en væsentlig rolle 4,5.
Derfor er PD en multifaktoriel sygdom, der primært initieres af akkumulering af mikrobiel plak – som følge af dysbiose af mikrobielle samfund – og af et overdrevet værtsimmunrespons på periodontale patogener, hvilket fører til nedbrydning af periodontalt væv 4,6. Blandt flere periodontale bakterier er den gramnegative anaerobe bakterie Porphyromonas gingivalis et af de vigtigste patogener i PD4. P. gingivalis indeholder et komplekst lipopolysaccharid (LPS) i dets vægge, et molekyle kendt for at inducere polymorfonukleær leukocytinfiltration og vaskulær dilatation i betændt parodontalt væv7. Dette resulterer i produktion af inflammatoriske mediatorer, såsom interleukin 1 (IL-1), IL-6 og IL-8, tumornekrosefaktor (TNF) eller prostaglandiner, med en efterfølgende osteoklastaktivering og knogleresorption, hvilket fører til vævsødelæggelse og ultimativt tandtab3.
Blandt de forskellige fordele ved dyremodeller er evnen til at efterligne cellulære kompleksiteter som hos mennesker eller være mere nøjagtige end in vitro-undersøgelser , der udføres på plastoverflader med begrænsede celletyper8. Til modellering af PD eksperimentelt in vivo er forskellige dyrearter blevet brugt, som ikke-menneskelige primater, hunde, svin, fritter, kaniner, mus og rotter9. Rotter er imidlertid den mest omfattende undersøgte dyremodel for patogenesen af PD, fordi de er billige og nemme at håndtere10. Deres dental tandkødsvæv har lignende strukturelle træk som humant tandkødsvæv, med en lav gingival sulcus og junctional epitel fastgjort til tandoverfladen. Desuden, som hos mennesker, letter forbindelsesepitelet passagen af bakterielle, fremmede materialer og ekssudater fra inflammatoriske celler 9.
En af de mest rapporterede eksperimentelle modeller af PD-induktion hos rotter er placeringen af ligaturer omkring tænderne, hvilket er teknisk udfordrende, men pålideligt10. Ligaturplaceringen letter tandplak og bakteriel akkumulering, hvilket genererer en dysbiose i tandkødssulci, der forårsager periodontal vævsbetændelse og ødelæggelse11. Tab af periodontal binding og resorption af alveolær knogle kan forekomme på 7 dage i denne rottemodel8.
En anden dyremodel for PD består af injektion af LPS i tandkødsvævet. Som følge heraf stimuleres osteoklastogenese og knogletab. De histopatologiske træk ved denne model ligner humant etableret PD, karakteriseret ved højere niveauer af proinflammatoriske cytokiner, kollagennedbrydning og alveolær knogleresorption 6,8.
Formålet med denne undersøgelse var således at beskrive en simpel rottemodel af eksperimentel PD baseret på teknikkerne til P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) injektioner kombineret med ligaturplacering omkring de første maksillære molarer (M1). Dette er en model med lignende karakteristika som dem, der observeres ved human PD-sygdom, som kan bruges i studiet af sygdomsprogressionsmekanismer og fremtidige mulige behandlinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne metode beskriver induktionen af PD hos rotter efter en kombineret teknik med Pg-LPS-injektioner og ligaturplacering omkring M1, hvilket afslører, at signifikante ændringer i parodontalt væv og alveolær knogle kunne induceres i 14 dage efter denne metode.
Under denne procedure skal der lægges vægt på forskellige kritiske trin. Under dyrebedøvelse og procedureforberedelse er vurdering af den korrekte anæstesi under den kirurgiske proces afgørende for dens succes, ligesom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Proof of concept-indkaldelse 2020), af Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, medfinansieret af ESF Den Europæiske Socialfond og EFRU Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (kontrakt med M.M.B; FI18/00104) og af Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (kontrakt med M.M.F.C; FPI/040/2020). Forfatterne takker Dr. Anna Tomás og Maria Tortosa for deres hjælp på den eksperimentelle kirurgi og platform for IdISBa. Endelig tak til ADEMA School of Dentistry for adgangen til CBCT-scanneren.
Materials
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” – 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
References
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
